免疫組庫測序打開藥物研發(fā)新視野（一）：什么是免疫組庫測序？、免疫組庫測序打開藥物研發(fā)新視野（二）：免疫組庫檢測的方法有哪些？兩篇文章介紹了免疫組庫的基本概念、人體內(nèi)免疫組庫多樣性產(chǎn)生的生物學過程及免疫組庫常用檢測方法。本文將重點介紹免疫組庫測序在TCR相關(guān)的腫瘤免疫治療中的應(yīng)用，并對檢測結(jié)果進行生物學意義解讀。

PART 01

TCR（T細胞受體）是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵受體，它們在腫瘤治療中發(fā)揮核心作用。TCR主要存在于T細胞表面，負責識別并結(jié)合由抗原呈遞細胞（如巨噬細胞、樹突狀細胞等）通過MHC分子（主要組織相容性復(fù)合體）呈遞的多肽片段。當TCR與抗原-MHC復(fù)合物結(jié)合后，會觸發(fā)T細胞活化和增殖，從而分化為不同的效應(yīng)子T細胞亞群，包括CD8+ 細胞毒性T細胞和CD4+ 輔助T細胞。

CD8+ 細胞毒性T細胞（CTLs）能夠特異性識別并消滅表達異?？乖哪[瘤細胞。它們通過與腫瘤細胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子結(jié)合而被激活，該復(fù)合體呈遞的是來源于腫瘤細胞內(nèi)部的多肽片段。當CD8+ T細胞識別到這些抗原后，它們會釋放穿孔素、顆粒酶和其他效應(yīng)因子，導(dǎo)致靶向的腫瘤細胞裂解死亡。

CD4+ 輔助T細胞（Th cells）能夠識別抗原呈遞細胞（如樹突狀細胞）上MHCⅡ類分子結(jié)合的肽段，并通過與這些細胞相互作用而被激活。激活后的CD4+ T細胞可以分化為不同的輔助亞型，包括Th1、Th2、Th17等，分別分泌不同類型的細胞因子來激活和調(diào)控其他免疫細胞。并且通過分泌細胞因子來調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能，包括促進B細胞產(chǎn)生抗體（參與體液免疫），以及激活巨噬細胞、自然殺傷細胞等進行細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這對于疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。

腫瘤免疫治療通過增強患者的免疫系統(tǒng)識別和攻擊腫瘤細胞的能力，或克服腫瘤細胞免疫逃逸機制，從而達到控制、縮小甚至消除腫瘤的目的，包括但不限于免疫檢查點抑制劑、CAR-T細胞療法、腫瘤疫苗以及腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）療法等。腫瘤免疫治療通過多種機制直接影響免疫系統(tǒng)中各類免疫細胞的數(shù)量、種類和功能狀態(tài)，TCR免疫組庫測序可以檢測腫瘤特異性的T細胞克隆、評估腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)、評估免疫治療效果、監(jiān)測治療前后的免疫應(yīng)答變化，并且可以輔助預(yù)測治療反應(yīng)與患者預(yù)后。

PART 02

熙寧|精翰NGS實驗室開發(fā)了成熟的免疫組庫測序生信分析流程，對檢測樣本進行 T 細胞受體基因克隆鑒定檢測，并對受檢者的不同時間節(jié)點的樣本進行 T 細胞受體基因克隆鑒定檢測，對特定的TCR 的克隆比例，克隆多樣性、V/J 基因的使用頻率進行統(tǒng)計，識別樣本間的共有克隆，并追蹤不同樣本 TCR 指標的動態(tài)變化，如克隆總數(shù)、克隆類型、多樣性指數(shù)、克隆豐度等，輔助評估免疫治療的臨床效果。

本文將以TRB為例，從克隆多樣性、CDR3長度分布、V-J基因使用頻率分布等方面對單個樣本的TCR免疫組庫測序結(jié)果進行展示，并從生物學角度對檢測結(jié)果進行解讀（注：圖示中所有數(shù)據(jù)均來自虛擬樣本）。

計算樣本TCR組成多樣性的指標有Shannon’s entropy，Inverse Simpson’s index，Evenness，Clonality。

其中：s 表示實際觀測到的 TCR 重組序列的數(shù)目；P_i表示第 i 個 TCR 重排序列在所有 TCR 中所占的比例。

Shannon 和 Inverse Simpson 值越大，說明樣本的 TCR 多樣性越高。Evenness 的取值范圍為 0~1，指樣本的均勻度。 Clonality 的取值范圍為 0~1，指樣本的克隆性。

在某些疾病狀態(tài)下，例如自身免疫性疾病、某些感染疾?。ㄈ鏗IV感染）以及癌癥，可能會觀察到TCR CDR3長度譜的改變。比如，在某些腫瘤患者中，可能會發(fā)現(xiàn)TCR CDR3的長度分布出現(xiàn)偏移，這可能是由于腫瘤特異性T細胞克隆擴增或者免疫反應(yīng)失衡所導(dǎo)致。此外，某些病毒感染后，為了應(yīng)對病毒抗原變異，T細胞庫可能會產(chǎn)生更多具有特定CDR3長度的克隆。

統(tǒng)計樣本內(nèi)CDR3區(qū)域的核苷酸序列的長度分布與頻率的關(guān)系，柱狀圖分別由頻率最高的20種CDR3氨基酸序列與V片段填充，結(jié)果分別見圖1與圖2：

圖1 CDR3 核苷酸序列長度與Top20 序列分布直方圖

圖2 CDR3 核苷酸序列長度與Top V片段分布直方圖

上圖中橫坐標表示CDR3核苷酸序列的長度，縱坐標表示對應(yīng)長度CDR3數(shù)量在所有CDR3的比例，展示頻率最高的 20 種 V 片段的分布。

截止到2024年2月26日，根據(jù)IMGT數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計，人類基因組總共包含 237-243 個 TR 基因，具體基因數(shù)取決于單倍體類型。每個單倍體基因組的功能性 TR 基因數(shù)量為 172-185。TR基因在染色體上的分布及各片段的數(shù)目統(tǒng)計如下表：

統(tǒng)計樣本內(nèi)V片段與J片段的使用頻率，結(jié)果分別見圖3與圖4，并統(tǒng)計V-J對的組合與使用頻率，結(jié)果見圖5與圖6：

圖3 V 基因使用頻率分布直方圖

上圖中橫坐標表示不同的V片段的名稱，縱坐標表示對應(yīng)V片段的使用頻率。

圖4 J 基因使用頻率分布直方圖

上圖中橫坐標表示不同的 J 片段的名稱，縱坐標表示對應(yīng) J 片段的使用頻率

圖5 V-J 基因?qū)κ褂妙l率分布環(huán)形圖

上圖為 V-J 對使用頻率分布環(huán)形圖?；?yīng)于不同的 V 片段和 J 片段，按其在樣本中的頻率進行縮放。絲帶代表 V-J 配對，其大小按配對頻率縮放

圖6 V-J 基因?qū)κ褂妙l率分布三維柱狀圖

上圖為 V-J 對三維柱狀圖。其中 X 軸表示 V 片段的名稱，Y 軸表示 J 片段的名稱，Z 軸表示克隆頻率。

在疾病進程中，TCR V和J基因的使用頻率偏好性可能出現(xiàn)顯著變化。這是因為疾病狀態(tài)下，某些特定的T細胞克隆可能因為針對某種抗原的高親和力而被強烈激活和擴增，從而導(dǎo)致某些V或J基因的使用頻率增加。例如，在某些類型的腫瘤中，已發(fā)現(xiàn)存在腫瘤特異性T細胞克隆的富集，表現(xiàn)為TCR V和J基因使用頻率的非隨機性分布。另一方面，在某些疾病相關(guān)的抗原刺激下，某些特定的TCR克隆占主導(dǎo)地位時，可能導(dǎo)致TCR多樣性下降，使得原本廣泛分布的V或J基因使用頻率變得集中。

隨著年齡的增長，免疫系統(tǒng)經(jīng)歷正常的生理衰老過程，稱為免疫衰老。在這個過程中，T細胞庫的多樣性可能會減少，一部分高頻使用的V或J基因組合可能會更頻繁地出現(xiàn)，同時罕見的組合可能減少，導(dǎo)致整體TCR多樣性降低。

此外，老年個體可能對新抗原的免疫響應(yīng)減弱，這也可能影響TCR V和J基因的使用頻率偏好性，使其傾向于維持以前接觸過的抗原的記憶反應(yīng)，而不是產(chǎn)生新的克隆來應(yīng)對新挑戰(zhàn)。

TCR V和J基因的頻率偏好性與疾病進程或年齡的相關(guān)性是復(fù)雜的，依賴于多種因素，包括個體的遺傳背景、環(huán)境暴露、疾病類型和嚴重程度等。

PART 03

在腫瘤過繼性免疫治療中，如CAR-T細胞療法和TILs免疫療法，對治療后的受檢者的不同時間節(jié)點的樣本進行TCR免疫組庫測序，統(tǒng)計注射液的TCR克隆殘留比例，識別樣本間的共有克隆，并追蹤不同樣本TCR指標的動態(tài)變化，可以輔助評估藥物的治療效果。下期文章即將介紹在腫瘤免疫治療中對時序樣本的檢測，敬請期待。

熙寧|精翰NGS實驗室應(yīng)用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測T/B細胞受體基因的克隆性重排，通過專業(yè)的生物信息學流程分析識別受體可變區(qū)，統(tǒng)計樣本的克隆多樣性及V/J片段的使用頻率，從而揭示個體的免疫表達譜。本檢測方法已經(jīng)經(jīng)過了完善的性能驗證，可以供申辦方直接使用。

熙寧|精翰NGS實驗室依據(jù)CAP質(zhì)量的要求，建立了完善的質(zhì)量體系。實驗室擁有NextSeq CN500測序儀，支持本地測序，且多次滿分通過CAP的能力驗證。按照質(zhì)量體系的要求，實驗室建立了豐富的檢測方法，全面支撐藥物的安全性評估、治療效果評估、入組篩查和生物標志物的探索等，在藥物研發(fā)的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用：

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