小干擾RNA(small interfering RNA; siRNA)屬于小核酸藥物中重要的一種藥物類型，也被稱為短干擾RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是長度在20到25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，在生物學(xué)上有許多不同的用途。

其結(jié)構(gòu)如圖1a所示，雙鏈RNA由正義鏈和反義鏈組成，在3‘端有兩個(gè)堿基的游離，未經(jīng)修飾的siRNA在體內(nèi)很快被降解，目前主要采用納米遞送系統(tǒng)（圖1b）或者設(shè)計(jì)成GalNAc（乙酰半乳糖胺）-siRNA復(fù)合物（圖1c）。SiRNA藥物作用機(jī)理如圖2所示，siRNA片段與RISC（RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體）結(jié)合，RISC由Argonaute-2 （Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-結(jié)合蛋白（TRBP）組成，然后RNA的兩條鏈分開，其中一條鏈從復(fù)合物上分離，5'端雙鏈穩(wěn)定性最低的那條鏈被選擇出來，穩(wěn)定的并入沉默復(fù)合物中，可激活RNA干擾，與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)序列特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)mRNA降解。如圖3所示，目前全球已上市5款siRNA藥物，中國大陸暫無siRNA 藥物上市，大多處于均臨床和臨床前研究階段。

圖1a

Lipid polymer NPs

圖1b

圖1c

圖2

圖3

基于LC-MS檢測(cè)siRNA有諸多難點(diǎn)，比如化合物極性大，色譜保留弱，此外siRNA藥物為雙鏈結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)行雙鏈解鏈，檢測(cè)單鏈濃度，因此需要將正義鏈和反義鏈在色譜保留上盡量分離，降低雙鏈相互干擾的影響；由于藥物容易被限制性核酸內(nèi)切酶降解，因此需要重點(diǎn)關(guān)注穩(wěn)定性問題。

在質(zhì)譜檢測(cè)方面，由于其檢測(cè)局限性，對(duì)于分子量較大的siRNA藥物，一般以多電荷形式呈現(xiàn)，此外強(qiáng)酸性化合物需要在負(fù)離子模式下進(jìn)行，該藥物還易與金屬離子螯合，諸多因素導(dǎo)致了LC-MS檢測(cè)siRNA在靈敏度方面具有巨大的挑戰(zhàn)。常規(guī)的樣品前處理（蛋白質(zhì)沉淀、液液萃取、固相萃?。┓椒ú荒苓m用于siRNA藥物提取，因此需要在提高提取回收率、前處理效率和結(jié)果重現(xiàn)性做出更多的努力，下面總結(jié)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

一、 前處理

本實(shí)驗(yàn)采用液液萃取方法，如圖4，該方法前處理簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，重現(xiàn)性好，成本低廉，非常適合高通量的樣品前處理。實(shí)驗(yàn)操作需在冰浴黃光下操作保證樣品中待測(cè)物穩(wěn)定性。

圖4

二、線性、精密度和準(zhǔn)確度

本實(shí)驗(yàn)線性范圍為正義鏈5~2500 ng/mL，反義鏈5~2500 ng/mL，代表性標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5a（正義鏈）和圖5b（反義鏈），相關(guān)系數(shù)均r＞0.999。表明線性關(guān)系良好。

通過考察3個(gè)分析批，5個(gè)濃度質(zhì)控樣品，用以評(píng)估該方法的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度（含LLOQ QC的所有濃度質(zhì)控）準(zhǔn)確度偏差范圍為-7.6~10.1%、-8.5~9.3%，%CV最大值分別為7.3%、6.4%；批間精密度和準(zhǔn)確度（含LLOQ QC的所有濃度質(zhì)控）準(zhǔn)確度偏差范圍為-5.0~6.7%、-6.3~8.3%，%CV最大值為5.0 %、5.4%。

圖5a

圖5b

 三、選擇性

選擇性考察不同來源的空白基質(zhì)以及高脂，溶血基質(zhì)，評(píng)估空白基質(zhì)對(duì)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的干擾。同時(shí)考察了內(nèi)標(biāo)對(duì)待測(cè)物的干擾，圖6a為空白基質(zhì)圖譜，圖6b為定量下限和內(nèi)標(biāo)圖譜。

圖6a

圖6b

此外本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了不同個(gè)體間基質(zhì)效應(yīng)，高脂溶血基質(zhì)效應(yīng)，提取回收率、全血穩(wěn)定性，以及基質(zhì)中穩(wěn)定性，包含短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性、處理后樣品穩(wěn)定性等，所有驗(yàn)證項(xiàng)目均滿足接受標(biāo)準(zhǔn)后，表明該方法能用于后續(xù)的臨床樣品分析。siRNA質(zhì)譜檢測(cè)存在較大的技術(shù)挑戰(zhàn)，若對(duì)該檢測(cè)內(nèi)容非常感興趣可以關(guān)注熙寧生物于2023年02月23日進(jìn)行的寡核苷酸藥物質(zhì)譜檢測(cè)生物分析策略的視頻直播回放，相信經(jīng)過這場(chǎng)直播將會(huì)讓您對(duì)該類型藥物檢測(cè)有更多的了解，解答心中的諸多疑惑。

四、結(jié)束語

熙寧生物質(zhì)譜平臺(tái)能夠提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各項(xiàng)生物樣品分析服務(wù)，支持小分子藥物、多肽、寡核苷酸、PROTAC以及ADC等大分子藥物的方法開發(fā)、驗(yàn)證和樣品檢測(cè)。平臺(tái)配備了多套高端液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和Watson LIMS在內(nèi)的生物分析系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)以及各種先進(jìn)輔助設(shè)備，可以滿足各類型藥物臨床試驗(yàn)的檢測(cè)需求，極大提高了實(shí)驗(yàn)效率和質(zhì)量，更高效地幫助客戶進(jìn)行藥品研發(fā)。