一、背景介紹

DNA和組蛋白通過調(diào)節(jié)親和性和功能來進行修飾，這些修飾的改變是腫瘤的標志之一。表觀遺傳治療致力于促進或維持惡性表型的DNA甲基化模式或組蛋白翻譯后修飾正?；?。近年來，組蛋白的乙酰化修飾是表觀遺傳學領域的熱門研究方向。研究者發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙酰化是與機體生理功能及病理表征聯(lián)系最為緊密的修飾化之一。HDACs和HATs 等去乙酰化或乙?；赴悬c是表觀遺傳抗腫瘤領域研究的熱門靶點，在相關藥物的臨床試驗中，組蛋白乙?；降淖兓撬幬锆熜У囊粋€重要指標。

圖1. 組蛋白乙?；叭ヒ阴；感揎椣嚓P酶分子簡介

二、流式檢測組蛋白乙?；幕驹?/strong>

一般認為，組蛋白乙酰化修飾多數(shù)發(fā)生在組蛋白H3或H4N端特定的賴氨酸殘基上，目前市面上已有很多抗乙?；M蛋白H3和H4直接標記的流式抗體。臨床相關的組蛋白乙?；疢arker有很多，如H3K9ac、H3K14ac和H4K5ac等，使用對應Marker的抗體進行標記，通過流式檢測某熒光素對應通道的信號值或信號比值（如H3K9ac/H3），來反映細胞組蛋白乙酰化的強弱。

三、關于模擬臨床樣品的設計考量

1.生物基質的選擇

考慮到臨床分析，該檢測需采用全血或分離的PBMC進行。

圖2. 全血樣本白細胞中H3K9乙?；?/p>

2.不同水平組蛋白乙?；M臨床樣品的制備

在全血或PBMC體外加藥處理調(diào)節(jié)組蛋白乙?；磉_水平，生成高表達或低表達的模擬臨床樣品，處理不同時長后，獲取各個時間點的樣品進行流式細胞術檢測。

圖3. 西達本胺（HDACI）處理不同時長，

PBMC組蛋白乙酰化水平的變化

圖4. 不同藥物（包含HDACI和HATI）

處理后H3K9ac水平的變化

四、關于方案設計要點的考量

1.儲存條件對組蛋白乙?；降挠绊?/p>

據(jù)文獻報道，全血樣品可在臨床中心采集后盡量24h(建議不超過48h)內(nèi)于4°C運輸至檢測中心，盡快裂紅或裂紅固定，裂紅后的細胞盡快-80°C保存，裂紅固定后的細胞保存不超過一周，進行流式檢測分析，文獻結果如圖5。

該檢測可考慮熙寧生物自主產(chǎn)權的凍存全血的方法，無需裂紅，可直接凍存。

圖5. 患者給藥LBH589(HDACI)后，采集全血，裂紅固

定，流式細胞術檢測體內(nèi)白細胞組蛋白乙酰化水平的變化

2.固定、破膜或破膜固定劑的選擇對染色效果的影響

由于不同的固定、破膜或破膜固定劑的成分可能會影響抗體的結合以及導致熒光素分子降解，從而影響信號強度，甚至檢測不到陽性信號，因此需要選擇合適的固定、破膜或破膜固定劑。

圖6. 固定破膜試劑基本信息匯總

五、熙寧優(yōu)勢

蛋白的磷酸化、甲基化、乙酰化、ADP-核糖化修飾和泛素化等共價修飾的變化是細胞生理狀態(tài)，機體健康狀態(tài)，藥物是否發(fā)揮藥效的重要指標。在藥物臨床研究階段，檢測蛋白翻譯后修飾水平，評估給藥前后的變化情況，成為臨床階段一些小分子藥物的主要藥效學（PD）指標之一，可用于指導創(chuàng)新藥物二期臨床試驗的用藥劑量。

熙寧生物流式細胞轉化醫(yī)學團隊，具有10余年藥物開發(fā)和生物標志物檢測經(jīng)驗，并成功開發(fā)了超100種不同的生物標志物方法，用于臨床階段藥物安全性和有效性的評估，其中包括一系列基于流式平臺、ELISA和MSD平臺的磷酸化蛋白、甲基化蛋白、ADP-核糖化修飾、泛素化和乙酰化蛋白的檢測方法，助力藥物臨床研究。歡迎各位新老朋友，前來探討您感興趣的靶點和檢測方法。

參考文獻

1.Bates, Susan E. "Epigenetic therapies for cancer." New England Journal of Medicine 383.7 (2020): 650-663.

2.Watson, Maria, et al. "The study of epigenetic mechanisms based on the analysis of histone modification patterns by flow cytoametry." Cytometry Part A 85.1 (2014): 78-87.

3.韓韋鈺, et al. "組蛋白去乙酰化修飾調(diào)控心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展." 中國組織工程研究 27 (2023): 1-7.

4.Watson, Maria, and David Hedley. "Whole blood measurement of histone modifications linked to the epigenetic regulation of gene expression." Current Protocols in Cytometry 71.1 (2015): 6-36.

5.李建輝, et al. "流式細胞術檢測組蛋白乙?；椒椒ǖ慕⑴c應用." 遺傳 38.6 (2016): 581-587.

6.Glaser, Keith B., et al. "Gene expression profiling of multiple histone deacetylase (HDAC) inhibitors: defining a common gene set produced by HDAC inhibition in T24 and MDA carcinoma cell lines." Molecular cancer therapeutics 2.2 (2003): 151-163.

7.Rigby, Lin, et al. "Methods for the analysis of histone H3 and H4 acetylation in blood." Epigenetics 7.8 (2012): 875-882.

8.Obier, Nadine, and Albrecht M. Müller. "Chromatin flow cytometry identifies changes in epigenetic cell states." Cells Tissues Organs 191.3 (2010): 167-174.