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腫瘤免疫療法，如免疫檢查點抑制劑（ICIs），已被證明在治療多種人類癌癥中發(fā)揮了重要作用，如黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)和腎細胞癌等[1]。此外，患者腫瘤組織內(nèi)的免疫細胞亞群分布、相關(guān)細胞因子含量、免疫抑制狀態(tài)等已被用于多種類型癌癥的生存和預(yù)后研究[2]。同時，一些回顧性或探索性研究也顯示了腫瘤免疫微環(huán)境的狀態(tài)在預(yù)測腫瘤免疫治療效果方面的效果。
PART 01
mIHC/mIF在腫瘤免疫治療研究中的優(yōu)勢
早期，傳統(tǒng)IHC/IF顯色方法為深入了解免疫浸潤在指導(dǎo)后續(xù)臨床治療反應(yīng)中的作用提供了有價值的工具。但是，傳統(tǒng)IHC方法最大的局限性是在一張FFPF切片上只能對1 -3個靶標進行染色，而對于腫瘤免疫浸潤的評估，需要對多個蛋白靶點進行檢測，這就要求充足的組織學(xué)標本，但大多數(shù)的活檢樣本無法滿足。相比之下，基于多重免疫組織化學(xué)/免疫熒光(mIHC/mIF)的分析可實現(xiàn)在一張FFPE組織切片上進行多個生物標志物檢測，進而提供對包含浸潤性免疫細胞、癌細胞和基質(zhì)細胞在內(nèi)的復(fù)雜腫瘤微環(huán)境(TME)中各種細胞含量、分布以及空間關(guān)系的獨特視角 [3]。因此，mIHC技術(shù)可以在腫瘤免疫治療的研究中發(fā)揮重要的作用。
此外，mIHC/mIF在預(yù)測ICIs治療效果方面可能具有更高的準確性。Lu等人薈萃分析了來自50多個研究的抗PD-1/PD-L1治療數(shù)據(jù)，涵蓋10多種腫瘤類型和8000多名患者，使用ROC和AUC來檢驗多種生物標志物，如PD-L1 IHC、腫瘤負荷(TMB)、基因表達譜(GEP)和mIHC/mIF在預(yù)測PD-1/PD-L1抑制劑療效方面的準確性。結(jié)果顯示，與其他三種檢測類型相比，mIHC/mIF檢測的預(yù)測準確性最高（圖1）[4]。
圖1 不同生物標志物與抗PD-1/PD-L1治療后患者反應(yīng)的相關(guān)性[4]
PART 02
mIHC/mIF的預(yù)后和預(yù)測價值實例
目前，已有多個實驗室利用mIHC/mIF技術(shù)研究多種類型癌癥患者腫瘤組織內(nèi)免疫亞群的預(yù)后甚至預(yù)測價值。
Barua等人[5]利用mIHC方法對120例I-III期非小細胞肺癌患者的腫瘤標本進行分析，探討腫瘤微環(huán)境中肺癌細胞與特異性免疫細胞空間接近程度對預(yù)后的影響。該研究對CD8、CD4、Foxp3和CD68進行標記，然后利用一種新的G-cross空間距離分布方法分析每種細胞類型的豐度和空間位置以及它們彼此之間的接近程度，采用Cox比例風(fēng)險多元回歸分析淋巴細胞類型接近程度的影響。結(jié)果顯示（表1），腫瘤細胞與Foxp3+ Treg細胞相互作用的G-cross函數(shù)的曲線下面積(AUC)越大，經(jīng)年齡和陽性淋巴結(jié)數(shù)調(diào)整后的生存率越差(HR 1.52 (1.11-2.07)， P = 0.009)，表明在非小細胞肺癌中，核心腫瘤區(qū)域浸潤Treg細胞的增加是總生存率較差的獨立預(yù)測因子。然而，Treg-CD8的G-cross AUC越大，經(jīng)年齡和陽性淋巴結(jié)數(shù)調(diào)整后的生存率越高(HR 0.96 (0.92-0.99)，P = 0.042)，說明Treg細胞中CD8+毒性T細胞浸潤的增加能夠減輕這種效應(yīng)，并與更好的生存率顯著相關(guān)。
表1 G-cross AUC評分與臨床因素與總生存期的多因素Cox回歸分析[5]
T淋巴細胞比例為口腔鱗狀細胞癌(OSCC)患者的預(yù)后提供了信息。然而，尚未有研究同時評估HPV- OSCC腫瘤內(nèi)和腫瘤細胞附近免疫細胞的組成和位置，以及腫瘤免疫逃逸機制與臨床指標的關(guān)聯(lián)。因此，F(xiàn)eng等人[6]利用mIHC技術(shù)對119例 HPV- OSCC患者的腫瘤組織切片進行CD3+、CD8+、FoxP3+、CD163+和PD-L1+細胞成像，然后評估這些marker與患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示（圖2），侵襲邊緣大量的CD8+ T細胞與延長的總生存期(OS)顯著相關(guān)，而FoxP3+或PD-L1+細胞的數(shù)量與預(yù)后不相關(guān)。在這個研究中，最引人注目的是CD8+ T細胞30 μm內(nèi)FoxP3+或PD-L1+細胞的數(shù)量，與靠近CD8+ T細胞的大量抑制因子和總生存期縮短顯著相關(guān)。
圖2 FoxP3+ T細胞、PD-L1+ T細胞與CD8+ T細胞的距離對預(yù)后的影響[6]
Johnson等[7]對來自10個腫瘤研究中心166名黑色素瘤患者（發(fā)現(xiàn)隊列，n = 24； 驗證隊列，n = 142）在接受抗PD-1治療前的腫瘤活檢組織進行多重?zé)晒馊旧x定的生物標志物特征、PD-1/PD-L1相互作用評分和IDO-1/HLA-DR共表達被用來評估抗PD-1治療的結(jié)果。研究表明，發(fā)現(xiàn)隊列中PD-1/PD-L1相互作用評分和/或IDO-1/HLA-DR共表達與抗PD-1治療反應(yīng)密切相關(guān)(P = 0.0005)。相比之下，單獨的生物標志物(PD-1, PD-L1, IDO-1, HLA-DR)與治療反應(yīng)或生存無關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)驗證隊列中得到了重復(fù)：PD-1/PD-L1和/或IDO-1/HLA-DR相互作用高的患者更有可能產(chǎn)生反應(yīng)(P = 0.0096)，這些患者的無進展生存期(HR = 0.36;P = 0.0004)和總生存率(HR = 0.39; P = 0.0011)也得到顯著改善。在所有患者中，80% PD-1/PD-L1和IDO-1/HLA-DR相互作用水平較高的患者對PD-1抑制劑有響應(yīng)(P = 0.000004)。相比之下，PD-L1的表達并不能預(yù)測生存率。
圖3 發(fā)現(xiàn)隊列(n = 24)中應(yīng)答者(R)和無應(yīng)答者(NR)候選生物標志物特征的T檢驗分析[7]
為了確定免疫微環(huán)境是否會對非小細胞肺癌的臨床結(jié)果產(chǎn)生影響，Mazzaschi等[8]對NSCLC患者PD-L1表達、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)與nivolumab治療效果之間的相關(guān)性進行分析，該研究納入42例腺癌(ADC)和58例鱗狀細胞癌(SCC)的手術(shù)切除樣本以及26例接受nivolumab治療的晚期患者(13例ADC和13例SCC)的樣本進行分析。研究發(fā)現(xiàn)， 高密度的PD-1抑制受體低表達的CD8+淋巴細胞亞群與接受手術(shù)治療的NSCLC患者的總生存期呈正相關(guān)(OS: HR = 2.268; 95% CI, 1.056-4.871, p = 0.03)。此外，CD8+細胞中PD-1低表達是nivolumab治療患者的一個顯著特征，顯示出更長PFS (PFS: HR = 4.51;95% CI, 1.45-13.94, p = 0.004)。上述結(jié)果說明PD-1陰性效應(yīng)T淋巴細胞庫對晚期NSCLC切除術(shù)患者的生存和免疫治療反應(yīng)具有積極影響。
圖4 Kaplan-Meier曲線顯示PD-1-to-CD8 (D, F)和CD8-to-CD3 (E, G)分別對免疫治療晚期NSCLC患者DFS (D, E)和OS (F, G)的預(yù)測作用[8]
PART 03
小結(jié)
在腫瘤免疫治療時代，雖然免疫檢查點抑制劑（ICI）改善了晚期惡性腫瘤患者的生存和預(yù)后，但復(fù)雜的耐藥機制限制了臨床療效，需要更準確的預(yù)后和預(yù)測性生物標志物。新興的mIHC/mIF技術(shù)使我們能夠更好地表征TME，提供腫瘤組織內(nèi)的免疫細胞亞群的含量和空間排列的全面信息，識別新的生物標志物，將有助于更好地預(yù)測腫瘤免疫治療的臨床療效，揭示免疫治療藥物的作用機理，指導(dǎo)臨床用藥?？傊?，mIHC/mIF在癌癥免疫治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
PART 04
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參考文獻：
[1] Sun Z, et al. Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers. PLoS One. 2021 Feb 17;16(2):e0247238. doi: 10.1371/journal.pone.0247238. PMID: 33596250.
[2] Galon J, et al. Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours. J Pathol. 2014 Jan;232(2):199-209. doi: 10.1002/path.4287. PMID: 24122236.
[3] Tan WCC, et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 2020 Apr;40(4):135-153. doi: 10.1002/cac2.12023. Epub 2020 Apr 17. PMID: 32301585
[4] Lu S, et al. Comparison of Biomarker Modalities for Predicting Response to PD-1/PD-L1 Checkpoint Blockade: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol. 2019 Aug 1;5(8):1195-1204. doi: 10.1001/jamaoncol.2019.1549. PMID: 31318407.
[5] Barua S, et al. Spatial interaction of tumor cells and regulatory T cells correlates with survival in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2018 Mar;117:73-79. doi: 10.1016/j.lungcan.2018.01.022. Epub 2018 Feb 4. PMID: 29409671.
[6] Feng Z, et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2017 Jul 20;2(14):e93652. doi: 10.1172/jci.insight.93652. PMID: 28724788.
[7] Johnson DB, et al. Quantitative Spatial Profiling of PD-1/PD-L1 Interaction and HLA-DR/IDO-1 Predicts Improved Outcomes of Anti-PD-1 Therapies in Metastatic Melanoma. Clin Cancer Res. 2018 Nov 1;24(21):5250-5260. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0309. Epub 2018 Jul 18. PMID: 30021908.
[8] Mazzaschi G, et al. Low PD-1 Expression in Cytotoxic CD8+ Tumor-Infiltrating Lymphocytes Confers an Immune-Privileged Tissue Microenvironment in NSCLC with a Prognostic and Predictive Value. Clin Cancer Res. 2018 Jan 15;24(2):407-419. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-17-2156. Epub 2017 Oct 26. PMID: 29074606.
