隨著新的分子實體或者新的治療方式首次進入人體，基于安全性考量，CD3 based雙抗/多抗起始給藥劑量較低，而較低的給藥劑量對雙/多特異抗體基于LBA PK檢測方法的靈敏度需求提出了挑戰(zhàn)。本文將以已上市的雙特異抗體Blinatumomab (Blincyto)的生物學分析方法為案例，討論雙/多特異抗體基于結構-功能相關性原理；并以熙寧生物丨精翰生物采用的細胞平臺高靈敏度的方法學為案例，提出在劑量爬坡階段可采用Cell-based PK高靈敏分析方法作為解決方案，用于CD3 based雙抗/多抗和mRNA遞送雙抗/多抗的PK分析。

目前在全球獲批的雙特異抗體藥物有多款，Blinatumomab是其中最早之一，用于二線治療費城染色體陰性，復發(fā)或者難治的急性淋巴細胞白血?。ˋLL）。Blinatumomab是Amgen公司基于其雙抗平臺bi-specific T-cell engagers (BiTEs)研發(fā)的雙特異抗體。從結構上分析，Blinatumomab由一個抗CD19抗體的scFv（單鏈可變區(qū)片段）和一個抗CD3E抗體的scFv（單鏈可變區(qū)片段）通過柔性多肽共價偶聯(lián)組成圖1A, 其具體的氨基酸序列見下圖2。從功能上分析，Blinatumomab能夠同時結合ALL細胞表面的CD19抗原和T細胞表面的CD3E抗原，從而橋連T細胞接近ALL細胞，激活T細胞殺死ALL細胞圖2B。

Blinatumomab由兩個ScFv組成，缺少正?？贵w的Fc端，無法通過Fc介導的FcRn內吞作用來延長半衰期，相對于常規(guī)抗體長達2-3周的消除半衰期，Blinatumomab的消除半衰期非常短，只有1.25 ± 0.63小時（見表1，患者使用手提式的微型泵和端口系統(tǒng)，以4周為一個周期進行15 μg/m2/d持續(xù)的靜脈注射）。接下來本文將主要對Blinatumomab藥代動力學的分析方法進行討論。

Blinatumomab的藥代動力學分析方法不同于以配體受體結合實驗為平臺的傳統(tǒng)生物分析方法，其分析方法是基于其結構-功能相關性MOA機理，以細胞平臺為基礎建立起來。簡略的過程如下：

Blinatumomab的細胞學生物分析方法是基于其結構功能特點，基于T細胞的激活需要刺激和共刺激信號。單純的Raji或者Blinatumomab與T細胞孵育反應，均不能有效的激活T細胞導致T細胞細胞膜表面的CD69上調。只有采用Blinatumomab的抗CD19 ScFv一端橋接CD19+ Raji細胞, 抗CD3e ScFv一端刺激T細胞，才能利用B細胞共刺激激活T細胞，利用細胞膜標志物CD69進行檢測。CD69在T細胞膜上的上調程度和Blinatumomab的藥物濃度呈劑量依賴關系，從而起到定量分析的作用，該細胞學的生物學分析方法的定量下限能夠達到100pg/ml。

熙寧生物|精翰生物自主構建了NF-AT報告基因Jurkat穩(wěn)轉細胞系來替代Blinatumomab生物分析方法中的T細胞，采用相同的Raji細胞和Blinatumomab抗體，建立了Blinatumomab的細胞平臺的生物分析方法，通過激活Jurkat細胞檢測報告基因luciferase的表達，檢測化學發(fā)光信號值，Blinatumomab的劑量和化學發(fā)光信號值大小正相關，該定量方法的檢測下限能夠達到6.25pg/mL，LOD可達3pg/mL, 同時關鍵試劑僅需要標準品、現貨靶細胞和效應細胞，無需制備抗雙抗獨特性抗體，可快速開展，節(jié)約項目準備周期。具體的數據如下圖3：

基于熙寧生物丨精翰生物自主構建的靶細胞和效應細胞檢測體系，高靈敏Cell-based 的PK生物分析方法能夠檢測到1ug級別給藥劑量的PK血藥濃度，對于有較高細胞因子釋放風險的CD3 based雙抗/多抗來說，是檢測低至10pg/mL級別血藥樣品的最佳選擇。目前已在多個mRNA遞送雙抗/多抗, CD3 based 雙抗/多抗IIT和I臨床項目進行應用，有成熟方法學體系。同時通過定制靶細胞系，可實現TAA是CD19，或者是任意實體瘤靶點，具備靶點的廣譜適用性。方法學部分性能如下：

CLD18.2 CD3雙抗 高靈敏度方法學

CD3 CD19雙抗 方法學參數