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PART 01
諾貝爾生理學醫(yī)學獎microRNA
2024年諾貝爾生理學醫(yī)學獎授予科學家維克托·安布羅斯（Victor Ambros）和加里·魯夫昆（Gary Ruvkun），以表彰他們發(fā)現(xiàn)了微小RNA（microRNA）及其在轉錄后基因調(diào)控中的作用。這不僅是對microRNA在生物學基礎研究中的重要性的認可，更為藥物研發(fā)和臨床應用帶來了新的機遇。
圖1 遺傳信息從DNA到mRNA再到蛋白質(zhì)的流動
要理解這項發(fā)現(xiàn)的重要性，我們需要先了解生物體內(nèi)基因表達的基本過程。RNA作為中心法則的重要組成部分，起著承上啟下的作用。它不僅是遺傳信息傳遞的橋梁，也是基因表達調(diào)控的重要參與者。在細胞內(nèi)，RNA負責將存儲在DNA中的遺傳信息轉錄為可用于合成蛋白質(zhì)的信使RNA，并通過翻譯轉化為具有生物功能的蛋白質(zhì)。這一過程使得細胞能夠精確地響應內(nèi)外部環(huán)境的變化，從而保持生命活動的正常進行。
microRNA是一類很短的RNA分子，通常只有20~24個核苷酸長。這些微小分子不產(chǎn)生蛋白質(zhì)，而是通過影響其他 RNA分子來調(diào)節(jié)基因的活動。上世紀80年代，Ambros和 Ruvkun在研究線蟲生長相關的生理學機制時，偶然發(fā)現(xiàn)lin-4 基因產(chǎn)生的一小段microRNA，就像一個微型密碼，而這個密碼恰好能部分匹配lin-14基因末端的一些重復片段，當兩個分子相結合，就會阻止lin-14產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
然而，這個發(fā)現(xiàn)一開始并沒有引起太多關注。直到2000 年，Ruvkun 的實驗室發(fā)現(xiàn)了名為let-7的第二個microRNA。let-7不僅存在于線蟲中，還在人類和其他動物中被發(fā)現(xiàn)，這意味著microRNA調(diào)控機制在動植物界具有普遍性，由此引起了科研界的深度重視與廣泛研究。
PART 02
RNA的分類及功能
隨著科學技術的進步，RNA的研究也不斷深化。高通量測序技術的發(fā)展使得研究人員能夠全面分析細胞內(nèi)的RNA組成，揭示不同細胞類型和狀態(tài)下的轉錄組特征。RNA根據(jù)是否編碼蛋白質(zhì)可以分為編碼RNA（coding RNA）與非編碼RNA（non-coding RNA）。
編碼RNA（coding RNA）
編碼RNA即我們常知的mRNA，負責將DNA中的遺傳信息轉錄為蛋白質(zhì)。mRNA在細胞核中合成后，經(jīng)過一系列的加工和修飾（如加上5'帽和3'聚腺苷酸尾）后轉運到細胞質(zhì)中，供翻譯使用。
mRNA轉錄組測序通過比較不同組織類型、發(fā)育階段或處理條件下的轉錄組，揭示基因表達的動態(tài)變化。分析基因的表達水平可以揭示疾病相關的基因表達變化，幫助藥企與研究人員深入理解疾病機制，優(yōu)化藥物療效和安全性。
非編碼RNA（non-coding RNA）
非編碼RNA（non-coding RNA）通過多種機制互相作用，共同調(diào)控基因表達的各個階段。它們不僅影響轉錄后過程，還參與細胞內(nèi)信號傳導、代謝調(diào)節(jié)和細胞周期等重要生物過程。
除tRNA與rRNA外，其他非編碼RNA如微小RNA（microRNA）可以通過結合到目標mRNA上，抑制其翻譯或?qū)е缕浣到猓瑥亩{(diào)節(jié)特定基因的表達水平；長鏈非編碼RNA （lncRNA）則通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉錄和其他細胞過程；環(huán)狀RNA （circle RNA）以環(huán)狀結構存在，通常由內(nèi)含子剪接產(chǎn)生，吸附并抑制特定microRNA的功能，從而調(diào)節(jié)microRNA靶基因的表達；小干擾RNA （siRNA）是一類雙鏈小RNA，參與RNA干擾（RNAi）機制，通過降解特定mRNA來沉默基因表達；小核RNA（snRNA）主要存在于細胞核內(nèi)，參與mRNA前體的剪接及其他RNA加工過程；小核仁RNA（snoRNA）主要位于核仁中，參與rRNA的化學修飾和加工等等。這些非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了中心法則的內(nèi)涵，還為理解基因調(diào)控的復雜性提供了新視角。
非編碼RNA轉錄組測序正日益成為推動藥物研發(fā)和精準醫(yī)療的重要工具。通過非編碼RNA轉錄組測序，藥企能夠識別與特定疾病相關的非編碼RNA，從而發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點；由于非編碼RNA在體液中（如血液和尿液）相對穩(wěn)定，其表達水平也可以用于早期診斷和疾病預后評估；通過對特定非編碼RNA的功能研究，能夠揭示其在疾病發(fā)生過程中的作用，不僅有助于深入理解疾病的分子機制，還可以為開發(fā)新型治療策略提供理論依據(jù)；例如，lncRNA通過調(diào)控基因的轉錄或參與染色質(zhì)重塑，影響細胞增殖、分化和凋亡等過程。通過監(jiān)測特定非編碼RNA的表達變化，研究人員能夠判斷藥物是否有效，并識別潛在的副作用。這種實時的監(jiān)測手段有助于優(yōu)化治療方案，最大限度地提高藥物的療效和安全性。
PART 03
實驗端檢測：RNA-Seq建庫流程
圖２ 熙寧|精翰轉錄組測序?qū)嶒灱夹g路線
以mRNA建庫為例，總RNA抽提后需要測定濃度和純度，同時由于RNA容易降解，需要通過電泳測定RNA的完整度。
總RNA中含有大量的核糖體 RNA (rRNA)，約占總RNA 80-98%。對絕大多數(shù) RNA-Seq 應用來說，需要去除 rRNA 或捕獲mRNA，從而保證測序數(shù)據(jù)集中在轉錄組所需的部分并節(jié)省成本。mRNA的富集通常有兩種方式，Poly(A)捕獲使用Oligo(dT) 分子雜交mRNA的Poly(A)尾從而實現(xiàn)mRNA的富集。poly(A) 富集需要高質(zhì)量的 RNA，如果是放置時間長的組織樣本，RNA可能降解斷裂，同時由于對 poly(A) 尾的選擇，3' 端被富集，而5' 序列容易丟失，因此Poly(A)捕獲常存在捕獲效率低和偏好性的問題。
熙寧生物｜精翰生物采用rRNA去除的方法，rRNA去除原理是通過互補DNA寡核苷酸雜交和RNA酶H消化，去除與DNA寡核苷酸雙鏈化的rRNA和珠蛋白mRNA（mRNA中珠蛋白mRNA約占30%-70%），然后進行DNA酶處理以清除DNA寡核苷酸。rRNA去除的方法效率更高，可以保留更豐富的mRNA分子。
隨后經(jīng)過片段化和逆轉錄合成DNA，再經(jīng)過加A和接頭連接，以及擴增和純化，即完成建庫。由于DNA的兩條鏈均可以作為模板轉錄mRNA，如果無法區(qū)分模板的來源則會發(fā)生干擾。熙寧生物｜精翰生物采用鏈特異性建庫，保留了轉錄本的方向信息，可區(qū)分轉錄本的來源，避免了互補鏈的干擾。
PART 04
生信端分析：轉錄組測序數(shù)據(jù)分析
圖３ 熙寧|精翰轉錄組測序生信分析流程
熙寧生物｜精翰生物的轉錄組測序生信分析流程包括多個關鍵步驟，以確保數(shù)據(jù)的高質(zhì)量和準確性。首先，進行數(shù)據(jù)預處理，涵蓋數(shù)據(jù)拆分、測序元件序列去除、質(zhì)量控制和過濾，以及質(zhì)量指標統(tǒng)計。經(jīng)過質(zhì)控的數(shù)據(jù)將被比對至參考基因組，統(tǒng)計比對率和測序深度等指標。根據(jù)基因組特征，統(tǒng)計每個基因的表達豐度（RC，Ｒead Ｃount）并進行基因注釋，可視化基因的表達水平，進行樣本相關性分析及主成分分析，并針對有重復樣本和任意分組的無重復樣本進行差異基因分析與差異基因功能富集分析。轉錄組測序的高級分析包括蛋白網(wǎng)絡分析、基因集差異分析、基因集富集分析、免疫浸潤分析等。合并統(tǒng)計多個樣本的質(zhì)控信息進行綜合分析和展示。通過這一系統(tǒng)流程，為客戶提供全面而深入的轉錄組測序數(shù)據(jù)分析服務。
部分結果展示：
圖４ 熙寧|精翰轉錄組測序生信分析結果部分展示
PART 05
熙寧｜精翰生物RNA-Seq檢測服務
在生物醫(yī)學研究和藥物開發(fā)的前沿，熙寧生物｜精翰生物轉錄組測序服務已完成分析性能驗證，可全面分析組織、血液、石蠟包埋切片等樣本的mRNA表達情況，采用Roche KAPA試劑進行rRNA去除和鏈特異性文庫構建，保證文庫質(zhì)量和數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，使用Illumina測序儀完成上機測序。生信流程覆蓋基因差異表達分析、差異基因功能和通路注釋等，最終出具完整全面的實驗結果報告，可在5~8個工作日內(nèi)完成樣本分析全流程，助力申辦方開展藥物作用機制研究和生物標志物研究。
