前言

酶聯(lián)免疫斑點技術（Enzyme Linked Immunospot Assay，簡稱ELISPOT）是細胞免疫學研究中最為敏感的檢測方法，可以在單細胞水平對抗體分泌細胞(如B細胞)及細胞因子分泌細胞（如T細胞）進行檢測，該方法有極高的靈敏度，可達20-25斑點/100萬細胞，并且該方法能夠對抗原刺激后的活細胞進行功能性檢測，是疫苗領域藥效評估的關鍵檢測方法。隨著生物藥領域向腫瘤免疫深入邁進，ELISPOT技術也逐步成為基因治療，細胞治療（CART, TCRT），抗體/雙特異抗體藥物的生物分析領域的主流技術。

酶聯(lián)免疫斑點技術的基本流程

酶聯(lián)免疫斑點技術的基本原理是通過免疫細胞和對應的刺激物進行共培養(yǎng)，然后使用類似于ELISA雙抗夾心法對有刺激反應的免疫細胞進行檢測。由于免疫細胞激活機理的復雜性性，根據(jù)免疫細胞的來源選擇，刺激物的類型，刺激方式的不同會衍生出不同應用方向，不同靈敏度的ELISPOT檢測方法，其簡要的流程如圖1所示

圖1：ELISPOT技術基本操作流程

ELISPOT技術用于疫苗藥效學評估

目前ELISPOT技術最為廣泛應用的領域是用于感染性疫苗的臨床階段的藥效學評估，通常采用感染性病毒受體片段多肽庫（如新冠S蛋白多肽庫）作為刺激物，通常取臨床受試者的免疫細胞進行共孵育培養(yǎng)，通常為T細胞，有時會將T細胞進行細分為CD4+T細胞和CD8+T細胞，示例如下圖2康希諾生物Ad5載體重組蛋白新冠疫苗和輝瑞/BioNTech mRNA新冠疫苗使用ELISPOT技術用于疫苗的細胞免疫藥效學評估。

圖2：ELISPOT技術用于感染性疫苗的藥效學評估

ELISPOT技術也是腫瘤疫苗進行臨床階段的藥效學評估的重要檢測和篩選技術。相對于感染性疫苗，腫瘤疫苗引起人體的免疫反應較弱，同時由于腫瘤的異質性，腫瘤疫苗需要表達多樣化的腫瘤相關抗原或者新生抗原來使患者獲得對于腫瘤的免疫能力。ELISPOT技術基于其高靈敏性是腫瘤疫苗進行早期藥效學評估，判斷疫苗中各個相關抗原或者新生抗原是否對人體有效，支持后續(xù)的臨床決策非常關鍵的檢測技術，如圖3某DC腫瘤疫苗在單一腫瘤相關抗原多肽刺激下的T細胞免疫反應。

圖3：ELISPOT技術用于腫瘤疫苗腫瘤相關抗原的評估

在CDE發(fā)布的《新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究》指導原則中如圖4同時也強調了mRNA疫苗的質量研究需要進行體內效力試驗，推薦使用ELISPOT技術檢測評價mRNA疫苗的細胞免疫反應。

圖4：mRNA疫苗藥學生物活性研究內容

ELISPOT技術用于CART的免疫原性評估

CART細胞免疫療法是將來自人體的T細胞經過基因編輯，安裝上能夠識別腫瘤細胞的特異性蛋白受體，然后擴增后回輸回人體。由于基因編輯后的CART細胞能夠持續(xù)在人體擴增，并且特異性的識別腫瘤細胞，起到殺傷病人體內腫瘤細胞的作用，CART在人體的持續(xù)擴增和存續(xù)是CART細胞免疫療法取得杰出療效的關鍵，而人體針對CART細胞的免疫原性是影響CART細胞擴增存續(xù)的關鍵因素。目前上市靶向CD19的幾款CART產品其特異性蛋白受體均是鼠源的FCM63 scFV，有較強的免疫原性風險。關于文獻披露的FCM63 scFV是否存在免疫原性，每個上市CART產品測定的ADA發(fā)生率差異較大，但整體的結論是ADA不影響藥效。

目前上市的CART其適應癥均在血液腫瘤領域，在實體瘤領域鮮有突破，對此Wagner，2021在Immunogenicity of CAR T cells in cancer therapy的綜上中提到了一個可能的原因，由于現(xiàn)有的CART產品主要是靶向清除B細胞，同時在治療前均進行了清除淋巴細胞的處理，

CART產品注射后由于人體免疫細胞的缺失不會產生對CART細胞的免疫原性，短時間不會影響到CART的療效。隨著人體免疫系統(tǒng)的恢復，即使人體潛在存在針對CART的免疫原性，由于CART細胞會持續(xù)殺傷B細胞，中短期不會影響到CART的療效，但是針對CART的免疫原性T細胞會最終影響到CART的存續(xù)，影響到CART產品的長期藥效。同時文獻記載針對B細胞血液瘤的CART產品再次回輸不會取得很好的療效也是潛在CART免疫原性會影響到藥效的佐證。而在實體瘤領域，CART產品注射后人體如果產生了免疫原性，人體的B細胞會分泌針對CART的中和抗體，阻斷CART細胞殺傷腫瘤細胞，人體的T細胞會攻擊CART細胞，影響到CART細胞的大量擴增和存續(xù)，進而影響到CART產品針對實體瘤的療效?？偨Y來說，免疫原性是影響到CART療效，特別是實體瘤療效，以及是否能再次回輸?shù)年P鍵因素之一，如圖5。

圖5：免疫原性對血液腫瘤和實體瘤CART療效的影響

Brudno在2020年發(fā)表過對比試驗，使用ELISSOT技術檢測CART產品的免疫原性，評估攜帶FCM63的CART和全人anti-CD19的CART產品對于CART產品的存續(xù)的影響，如下圖，總結來說全人抗CD19 CART人血液中CART一個月后，有細胞免疫原性的個體和無細胞免疫原性的個體分組，體液循環(huán)中CART的數(shù)量沒有顯著差異。FCM63 CART人血液中CART一個月后，有細胞免疫原性的個體和無細胞免疫原性的個體分組，體液循環(huán)中CART的數(shù)量雖然差異不夠顯著，但是有變小的趨勢，如圖6。

圖6：FCM63和人源CD19抗體CART免疫原性和CART細胞存續(xù)的相關性

同種異體CART（通用型CART） 是CART藥物降低成本，提高患者可及性，滿足未被充分滿足臨床需求的關鍵，改造后的同種異體CART是否具有能夠達到預期的效果，使用健康個體的PBMC作為免疫細胞，輻照后的同種異體CART 作為刺激物，使用高靈敏度的ELISPOT技術進行評估是相對較優(yōu)的評估模式，見圖7。

圖7:ELISPOT技術用于通用型CART的免疫排異評估

ELISPOT試驗用于AAV基因治療藥物的細胞免疫原性評估

2019年FDA批準諾華公司研發(fā)的Zolgensma?（Onasemnogene abeparvovec，AVXS-101）在美國上市，用于治療2歲以下脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）的兒童患者。2022年8月STAT和Endpoints News先后報道，兩名兒童在接受Zolgensma治療后死亡，原因查明，罪魁禍首是急性肝功能衰竭。急性肝功能發(fā)生的根本原因是Zolgensma的病毒載體為AAV9對肝臟均具有較強的親嗜性，如下圖8所示該AAV9基因藥物注射到人體后會感染人的肝細胞，其衣殼蛋白會被肝細胞水解，形成HLAI病毒多肽復合物。人體的CD8+毒性T細胞會識別HLAI病毒多肽復合物，從而攻擊人體的肝細胞，引起級聯(lián)的炎癥反應，造成患者發(fā)生急性肝功能衰竭。通過ELISPOT的技術評估病毒載體在人體是否能引起T細胞免疫反應是臨床評估基因治療安全性重要的指標參數(shù)。

圖8：AAV基因治療藥物介導的細胞免疫原性引起的肝臟毒性機理

    基于AAV基因治療一次治療，長期有效的特征，AAV基因治療產品的細胞免疫原性將是影響其安全性，同時也是影響其有效性最為核心的考察項，如圖9所示，在一款凝血因子的AAV2基因治療藥物，其療效受限于機體逐步增強的針對于病毒載體的細胞免疫原性。

圖9：使用ELISPOT技術檢測因治療藥物介導的細胞免疫原性

熙寧酶聯(lián)免疫斑點技術（ELISPOT）技術經驗

酶聯(lián)免疫斑點技術（ELISPOT）作為最為靈敏的檢測技術，同時也是最容易受到干擾的檢測技術，其方法的穩(wěn)定性，樣品穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)解讀是關鍵。

ELISPOT的檢測結果除了受樣品的功能活性的影響，同時受到樣品的活性的影響和個體免疫學遺傳背景的影響，在驗證和檢測過程中需要設置嚴格的對照組，基于分組需要有完善的方法學驗證方案和驗證參數(shù)用于數(shù)據(jù)的解讀.如圖10

圖10. ELISPOT試驗分組設置以及驗證參數(shù)

PBMC的活性將極大的受到全血采集后的保存時間的影響，通常情況下全血采集后8小時內進行PBMC分離，PBMC的活性才能有效的保留，極大了限制了ELISPOT的應用。熙寧生物自主開發(fā)的全血穩(wěn)定劑配方和全血保存/分離條件的摸索積累，可將全血保存時間延長至30小時再分離PBMC，ELISPOT結果無顯著的變化，同時在48小時進行分離PBMC，ELISPOT結果能夠大部分保留，如圖11。

圖11.熙寧生物基于全血穩(wěn)定劑分離PBMC的全血穩(wěn)定性檢測結果

相比文獻記載，不經過全血穩(wěn)定劑處理的全血在放置24小時和48小時后，得到的斑點數(shù)目有80%以上的丟失如圖12，極大了延長了全血運輸穩(wěn)定性，增加了ELISPOT樣品分析的可及性。

圖12.未經全血穩(wěn)定劑分離PBMC的全血穩(wěn)定性檢測結果

熙寧生物提供臨床前和臨床階段細胞治療、基因治療和疫苗類藥物研發(fā)的細胞免疫原性檢測服務，歡迎咨詢。

參考資料：

1． CDE 新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究

2． Fcz A ,  Xhg B ,  Yhl C , et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial[J].  2020.

3． Sahin U ,  Muik A ,  Derhovanessian E , et al. Publisher Correction: COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and TH1 T cell responses[J]. Nature, 2021:1-1.

4． Wagner DL, Fritsche E,etc. Immunogenicity of CAR T cells in cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jun;18(6):379-393.

5． Brudno JN, Lam N,etc. Safety and feasibility of anti-CD19 CAR T cells with fully human binding domains in patients with B-cell lymphoma. Nat Med. 2020 Feb;26(2):270-280.

6． Colella P, Ronzitti G, Mingozzi F. Emerging Issues in AAV-Mediated In Vivo Gene Therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Dec 1;8:87-104.

7． Manno CS, Pierce GF, etc. Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat Med. 2006 Mar;12(3):342-7.

8． Validation of Cell-Based Assays in the GLP Setting-VALIDATION OF THE IFN-γ ELISPOT ASSAY.