T細(xì)胞的激活檢測(cè)指標(biāo)

T淋巴細(xì)胞（T lymphocyte）簡(jiǎn)稱T細(xì)胞，來(lái)源于骨髓的淋巴干細(xì)胞，在胸腺中分化、發(fā)育成熟后，通過(guò)淋巴和血液循環(huán)分布到全身免疫器官和組織中發(fā)揮免疫功能。它具有多種生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞，輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，對(duì)特異性抗原和促有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等，是身體中為抵御疾病感染、腫瘤發(fā)生而形成的英勇斗士。

T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫， T 淋巴細(xì)胞活化是免疫應(yīng)答的核心?；罨腡細(xì)胞表面表達(dá)CD69、CD25、CD38、CD71和HLA-DR等分子，Ki67的表達(dá)與CD71正相關(guān)。激活后早期(30-60 min)檢測(cè)到CD69基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但在4-6 h后迅速下降；CD69蛋白表達(dá)早在刺激2-3 h后就能檢測(cè)到。因此CD69被廣泛用作早期活化的標(biāo)記物。體外T細(xì)胞的活化可以用anti-CD3和anti-CD28的抗體或磁珠，PHA，PMA等刺激。

使用PHA體外刺激PBMC，然后將PBMC置于37℃，含有7%的CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CD3陽(yáng)性細(xì)胞群中CD25，CD69，CD71和HLA-DR的表達(dá)，結(jié)果如圖1， CD69是最早檢測(cè)到的分子，在15 h達(dá)到峰值，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量降低；CD25和CD71在刺激15 h才可以被檢測(cè)到，并分別于刺激后144 h和96 h達(dá)到峰值，HLA-DR在刺激后的峰值表達(dá)量最低，HLA-DR，CD25和CD71在刺激后可在較長(zhǎng)一段時(shí)間維持較高的表達(dá)。激活抗原表達(dá)量如表1。

除上文所述的T細(xì)胞激活指標(biāo)，CD38和Ki67也是T細(xì)胞的活化抗原，且Ki67的表達(dá)與CD71的表達(dá)呈正相關(guān)。用Anti-CD3/CD28抗體體外刺激PBMC，CD4+和CD8+細(xì)胞上的CD25，CD69，CD38，CD71和Ki67刺激后各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量如圖2和圖3。刺激早期就可以檢測(cè)到CD69的表達(dá)，在刺激4 h內(nèi)可以檢測(cè)到CD25，CD71，CD38的表達(dá)，但是Ki67在刺激4 h未見(jiàn)明顯增加；刺激后6 h，CD8+細(xì)胞群的CD25，CD69和CD38表達(dá)量顯著上調(diào)，在CD4+細(xì)胞群中這些活化抗原表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化，Ki67在CD4+和CD8+細(xì)胞群中表達(dá)量都顯著上調(diào)；刺激后24 h，CD4+和CD8+細(xì)胞群中的CD25和CD69表達(dá)都大于90%，CD71和Ki67在CD8+細(xì)胞群的表達(dá)明顯高于其在CD4+中的表達(dá)；刺激后48 h，CD25，CD69， CD71和Ki67在CD4+和CD8+細(xì)胞群的表達(dá)量均達(dá)到90%以上且一直持續(xù)到72 h（除CD69），CD69的表達(dá)在刺激后72 h則呈下降趨勢(shì)；CD38在CD8+細(xì)胞群的表達(dá)于刺激后48 h達(dá)到90%以上，而在CD4+細(xì)胞群則在刺激后72 h達(dá)到90%以上。

圖2

圖3

臨床應(yīng)用案例

在喉癌患者中，腫瘤組織中的早期活化抗原CD69和CD71表達(dá)高于健康人的上皮組織，晚期活化抗原CD25與健康人的表達(dá)量無(wú)明顯差異，另一晚期活化抗原HLA-DR在腫瘤組織的表達(dá)量高于健康人，用PHA分別刺激腫瘤組織細(xì)胞和健康人上皮細(xì)胞后的結(jié)果與不刺激的結(jié)果類似，如下 表2。

外周血中CD4+和CD8+細(xì)胞群的活化抗原表達(dá)與腫瘤組織表達(dá)差異較大，在喉癌患者的外周血中，CD69，CD71和HLA-DR在CD8+細(xì)胞群中的表達(dá)略高于健康人，在CD4+細(xì)胞群中的表達(dá)則無(wú)明顯差異，CD25的 表達(dá)在CD4+和CD8+細(xì)胞群中均與健康人無(wú)差異，如下表3.

對(duì)于T細(xì)胞激活以及免疫系統(tǒng)激活類型的藥物，如IL2類藥物及多特異性抗體、IL15類藥物及多特異性抗體、CD3類的多特異性抗體，靶向OX40、CD40、4-1BB等的激動(dòng)劑類抗體，以及藥物作用中會(huì)減少Treg亞群，進(jìn)而可能造成免疫系統(tǒng)的激活的藥物類型，進(jìn)行T細(xì)胞激活檢測(cè)指標(biāo)的檢測(cè)，都是一項(xiàng)重要的藥效或者安全性指標(biāo)。部分信息可以參考之前的公眾號(hào)文章《單抗激動(dòng)劑藥物應(yīng)該如何做臨床PD檢測(cè)——以O(shè)X40單抗為例》。

熙寧生物在支持藥物的臨床分析中，已經(jīng)積累的大量經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)完成和正在進(jìn)行的臨床研究有十余個(gè)。已經(jīng)積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，主要包括：

1.基于流式細(xì)胞術(shù)的T細(xì)胞激活指標(biāo)分析，包括4-1BB，CD69，HLA-DR，CD25等亞群占比分析；

2.基于流式細(xì)胞術(shù)的淋巴細(xì)胞亞群分析，具體包括T, B, NK, Mono等亞群的占比和絕對(duì)數(shù)量分析; Treg 亞群分析；T cell EM，CM等亞群分析；

3.基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞增殖分析，包括Ki67+占比分析和EdU+細(xì)胞陽(yáng)性率分析；

4.基于流式細(xì)胞術(shù)的受體占位率分析；

5.基于流式細(xì)胞術(shù)的受體表達(dá)量分析；

6.基于MSD，ELISA，Luminex和CBA的細(xì)胞因子分析；

7.基于ELISPOT的T細(xì)胞，B細(xì)胞激活分析。

參考文獻(xiàn)

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