前言

Tebentafusp是一款TCR/CD3雙特異融合蛋白藥物，靶向gp100表達(dá)的腫瘤，同時是首款以T細(xì)胞受體為骨架的大分子藥物。根據(jù)Immunocore和Adaptimmune披露Tebentafusp的臨床前的研究資料文獻，筆者梳理了α-CD3為骨架的雙特異藥物需要進行臨床前體外試驗，以及以人的免疫細(xì)胞為核心的，種屬特異性的體外試驗對首次人體試驗安全劑量的選擇的重要指導(dǎo)意義，討論臨床前以人免疫細(xì)胞的體外試驗?zāi)Ｐ腿〈窍嚓P(guān)動物模型進行安全性、有效性評估和安全劑量預(yù)測的范式轉(zhuǎn)移的可行性，梳理臨床前體外試驗包的主要內(nèi)容。

Tebentafusp臨床前體外試驗

隨著CTLA-4抗體, PD1/PDL1抗體，CART和CD3 based雙特異藥物在近10年不斷獲批上市并廣泛應(yīng)用腫瘤治療領(lǐng)域，腫瘤免疫療法已成為新的藥物研發(fā)的范式，不斷有腫瘤免疫相關(guān)的新靶點，新藥物形式實體從臨床前進入臨床。在腫瘤免疫治療藥物研發(fā)迅猛發(fā)展的同時，也暴露出了一些風(fēng)險，其中影響比較深遠(yuǎn)的是采用不合適的臨床前的藥物評估模型無法充分的預(yù)估臨床副作用導(dǎo)致的安全性風(fēng)險。比較典型的案例是抗CD28抗體TGN1412在健康受試者中引起的劇烈的危機生命的細(xì)胞因子釋放綜合征，CD3/CD19雙抗藥物blinatumomab在病人中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)毒性等。究其原因是目前傳統(tǒng)的臨床前的動物模型用來預(yù)測人來源的免疫調(diào)節(jié)藥物的安全性和有效性并不合適，動物/人的免疫細(xì)胞/免疫蛋白和治療藥物的互作強度存在差異，人來源的治療藥物在動物體內(nèi)會產(chǎn)生抗藥抗體影響到藥代動力學(xué)分布，進而影響到安全性和有效性評估。      

ICHS6 和 ICHS9 強調(diào)藥物的臨床前研究需要確保藥物在相關(guān)種屬具備藥物活性，如果做不到這點，可以考慮體外的方法。已經(jīng)有越來越多案例表明人種屬來源的體外試驗?zāi)軌虍a(chǎn)生有價值的，能夠為體內(nèi)預(yù)測提供有幫助性的結(jié)果，并且在臨床階段選擇最低預(yù)期生物有效水平（Minimal Anticipated Biological Effective Level）的起始濃度非常有指導(dǎo)意義。

以Tebentafusp的臨床前研究數(shù)據(jù)為典型案例，如下圖1 Immunocore和Adaptimmune的 科學(xué)家介紹了在有效性，安全性和特異性方面進行評價臨床前的體外方法的測試項。

                     圖1：臨床前體外試驗測試項

臨床前體外免疫學(xué)試驗包分析

Tebentafusp的臨床前體外免疫學(xué)試驗包總結(jié)下來可分為以下內(nèi)容：

有效性評估-體外人T細(xì)胞激活和殺傷，使用的方法分析

1. 基于人PBMC  Tebentafusp介導(dǎo)特異性的腫瘤細(xì)胞殺傷試驗，采用的是LDH釋放殺傷模型, IncuCyte 凋亡檢測模型，結(jié)果間圖2

2. 基于人PBMC和特異性的腫瘤細(xì)胞作用，Tebentafusp介導(dǎo)的T細(xì)胞的激活測定，采用的是ELISPOT檢測IFNγ的T細(xì)胞激活性模型。

  圖2：體外腫瘤細(xì)胞殺傷試驗結(jié)果

通過細(xì)胞殺傷試驗中Tebentafusp梯度稀釋的劑量結(jié)果，確定Tebentafusp在1pM-1nM的范圍內(nèi)有有效的殺傷效果，確定最低預(yù)期生物有效水平為1pM.

安全性評估-體外人T細(xì)胞激活和細(xì)胞因子釋放，使用的方法分析

1. 靶點特異性，非腫瘤特異性的活性測定。主要采用的是不同抗原表達(dá)豐度的腫瘤細(xì)胞，不同捐獻者的黑色素細(xì)胞進行對比評估，使用ELISPOT檢測T細(xì)胞的激活進行測試，結(jié)果見圖3。Tebentafusp在比較敏感的受試者中藥物濃度達(dá)到1pM-10pM會出現(xiàn)皮膚相關(guān)的副作用，在大部分受試者中10pM-100pM會出現(xiàn)皮膚相關(guān)的副作用，在1nM以上時會丟失特異性。

2. 非靶點，非腫瘤特異性的活性測定。主要采用的是在全血中Tebentafusp細(xì)胞因子釋放，檢測上清IL-6, TNF-α,IL-2 and IFNγ，文章沒有描述方法的細(xì)節(jié)，筆者認(rèn)為基于TGN1412案例中的方法2，從安全性角度來說，全血的刺激應(yīng)包括，液相刺激，濕法固相刺激和干法固相刺激等模型。

 圖3：靶點特異性，非腫瘤特異性的活性測定

基于體外安全性的結(jié)果過大于1nM Tebentafusp會特異性減弱，結(jié)合有效性的檢測數(shù)據(jù)，最終確定的臨床劑量擴展的范圍在10pM-100pM.

總結(jié)討論：

根據(jù)相關(guān)文獻記載，與非人靈長類動物（NHPs）相比，人類T細(xì)胞激活后，具有更強的增殖反應(yīng)。具體的原因可能是相對于非人靈長類動物，人的CD33相關(guān)的siglec糖蛋白有明顯的下調(diào)。CD33-siglec糖蛋白軸具備抑制T細(xì)胞激活的重要調(diào)節(jié)功能，所以免疫調(diào)節(jié)劑特別是免疫激動劑在非人的靈長類動物模型中，其免疫激活能力將會被低估，使用靈長類動物模型的安全劑量外推到人體用量，有極大的安全性風(fēng)險，這也是CD28超級激動劑在首次人體試驗出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床試驗的根本原因。

基于免疫調(diào)節(jié)劑的動物模型的非相關(guān)性，美國先后發(fā)表了An FDA oncology analysis of CD3 bispecific constructs and first-inhuman dose selection，An FDA oncology analysis of immune activating products and first-in-human dose selection兩篇文章推薦使用基于人免疫細(xì)胞的更加具備相關(guān)性的體外試驗?zāi)Ｐ偷臋z測結(jié)果進行CD3雙抗和免疫激動劑的人體首次用量劑量的外推。具體如圖4

圖4:FDA推薦使用體外的人免疫細(xì)胞試驗的數(shù)據(jù)外推首次人體劑量

熙寧生物臨床前體外免疫學(xué)試驗服務(wù)

熙寧生物有非常豐富的臨床前和臨床階段基于人免疫細(xì)胞的體外有效性和安全性評估的項目經(jīng)驗，建立了多個基于人免疫細(xì)胞的體外受體占位，細(xì)胞免疫殺傷/激活/增殖/細(xì)胞因子釋放試驗?zāi)Ｐ??？蔀榘–D3 Based雙特異藥物在內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)劑提供全套的臨床前體外免疫學(xué)試驗包，服務(wù)臨床前安全性和有效性的評估，助力首次人體臨床試驗的安全有效劑量的選擇。

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1.基于人PBMC的細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞檢測：

2．基于流式細(xì)胞技術(shù)進行人全血的T細(xì)胞增殖測定和藥物受體占位測定：

3. 基于ELISPOT平臺藥物作用下激活人PBMC激活的IFNγ檢測

4.基于液相，濕法固相和干法固相刺激模型人PBMC/全血的細(xì)胞因子釋放測定