在探索疫苗研究前沿：細胞免疫原性的應用與挑戰(zhàn)（上）一文中，我們已經(jīng)對細胞免疫原性在新冠疫苗、VZV疫苗、腫瘤治療性疫苗，以及新佐劑研究中的應用進行了介紹。承接前文，本文將繼續(xù)針對細胞免疫在疫苗臨床研究中的應用和難點進行探討。

PART 01

《預防用疫苗臨床可比性研究技術(shù)指導原則》（2019年），以體液免疫為主的疫苗，其免疫原性替代終點通常采用接種后免疫應答率（包括抗體陽轉(zhuǎn)率等）和抗體幾何平均滴度（GMT）/幾何平均濃度（GMC）及其增長倍數(shù)。鑒于免疫學理論及檢測方法的進展迅速，鼓勵同時開展細胞免疫學指標的探索，更全面地反映疫苗誘導的免疫應答反應。

《新型冠狀病毒預防用疫苗臨床研究技術(shù)指導原則》（試行，2020年），對于細胞免疫功能評價，建議檢測抗原特異性T細胞反應及相關(guān)的細胞因子等。建議考慮的檢測指標：特異性T細胞：CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg細胞亞群；CD3+T細胞、CD20+B細胞和CD16+NK細胞的比例。細胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平。若細胞免疫對于評價疫苗（如病毒載體疫苗、核酸疫苗）的免疫原性具有重要意義，則細胞免疫應作為必需的免疫原性研究內(nèi)容。病毒載體疫苗、核酸疫苗建議進行細胞免疫的持久性觀察。

《新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究技術(shù)指導原則》（試行，2020年），生物學活性檢測應體現(xiàn)疫苗體液免疫和細胞免疫，體內(nèi)效力試驗需根據(jù)mRNA疫苗理論的免疫反應原理應評價其體液免疫和/或細胞免疫的生物活性。建議建立檢測評價細胞免疫的方法（如利用細胞因子ELISPOT檢測評價特異性CTL反應等方法）進行細胞免疫效價的評價。

《腫瘤治療性疫苗臨床試驗技術(shù)指導原則》（征求意見稿，2022）：對于多種抗原組分的腫瘤治療性疫苗來說，抗腫瘤免疫反應可能涉及多種組分，需要多種檢測分析來識別和檢測免疫反應的不同組分。常見的檢測方法有中和抗體檢測、細胞因子檢測、四聚體檢測、ELISPOT檢測等。針對誘導的免疫應答類型（體液免疫或細胞免疫）選擇合適的檢測方法，建議使用至少兩種免疫學檢測方法來評估抗腫瘤免疫反應。且建立的檢測方法應經(jīng)過驗證，以確保方法的有效性和數(shù)據(jù)的可靠性。

PART 02

細胞因子的產(chǎn)生在免疫反應中起重要作用。細胞因子參與許多不同的途徑，包括 IFN γ 誘導許多抗病毒蛋白、IL-2 誘導T細胞增殖以及 TNF α 抑制病毒基因表達和復制，此外，細胞因子不是預先形成的因子，而是響應細胞活化而迅速產(chǎn)生和分泌。

酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（enzyme linked immunospot assay， ELISPOT）和基于流式細胞術(shù)的胞內(nèi)細胞因子染色（intracellular cytokine staining，ICS）是評價疫苗誘導的細胞免疫應答最常用的兩種檢測方法。

表1  疫苗細胞免疫檢測方法：ELISPOT和ICS

酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）是細胞免疫研究中最為靈敏的檢測方法，可以在單細胞水平對抗體分泌細胞(如B細胞)及細胞因子分泌細胞（如T細胞）進行檢測，該方法有極高的靈敏度，可達20-25斑點/100萬細胞，并且該方法能夠?qū)乖碳ず蟮幕罴毎M行功能性檢測，是疫苗領(lǐng)域藥效評估的關(guān)鍵檢測方法。此外，ELISPOT技術(shù)在基因治療，細胞治療，抗體/雙特異抗體藥物等臨床生物分析領(lǐng)域得到越來越多的應用。

胞內(nèi)細胞因子染色（ICS）是一種基于流式細胞術(shù)的檢測方法，可檢測免疫細胞受到刺激后細胞因子的產(chǎn)生和積累。ICS既可以對細胞內(nèi)表達的細胞因子進行檢測，也可以使用細胞表面標志物或MHC多聚體進行免疫表型分析，以檢測抗原特異性反應免疫細胞亞群，使其成為一種極其靈活和通用的方法。

PART 03

用于細胞免疫評估的樣品為PBMC，在非臨床研究中，考慮到采血量的限制通常取實驗動物的脾臟和淋巴結(jié)組織后直接進行PBMC的分離，而在臨床研究中，需要采集外周血后進行PBMC的分離。

PBMC的活性和功能對細胞免疫原性檢測結(jié)果的準確性至關(guān)重要，臨床中心采集外周血后到分離PBMC的時長、提取方式、凍存方式、運輸條件、解凍和復蘇步驟等環(huán)節(jié)均可能會影響到PBMC的活性，并進一步影響后續(xù)試驗結(jié)果的評估。因此，細胞免疫原性檢測前需要規(guī)范化PBMC的處理方式，在保留較大提取收率的同時，也要有效維持PBMC的活性和功能。

圖1  全血放置24h和48h會顯著影響PBMC活性以及特異性的細胞因子分泌 ^[20]

通常情況下需要在全血采集后的8小時內(nèi)完成PBMC分離，PBMC的活性才能有效的保留。有研究顯示，全血放置24h和48h會極大的顯著影響PBMC活性以及由抗原刺激誘導的細胞因子分泌。

在進行疫苗臨床的細胞免疫原性評價時，首先推薦在臨床醫(yī)院采集新鮮的外周血后直接進行PBMC的分離，即采即分，而后進行檢測或放置液氮進行長期保存，然而，臨床醫(yī)院通常不具備分離PBMC分離的環(huán)境、設(shè)備或人員操作，在疫苗大規(guī)模、多中心臨床研究中也無法做到操作統(tǒng)一和分離出來的PBMC質(zhì)量統(tǒng)一。其次，可以在臨床醫(yī)院采集外周血后在一定的時間內(nèi)運輸至中心實驗室統(tǒng)一進行PBMC的分離和檢測，并對從全血采集到PBMC分離的放置時長進行系統(tǒng)的驗證，然而，對PBMC活性，運輸時效性、物流費用等臨床運營均造成極大的挑戰(zhàn)。

PART 04

圖2 熙寧生物|精翰生物全血穩(wěn)定劑可將全血分離PBMC前放置時間延長至48小時

基于PBMC為研究對象極大了限制地疫苗的臨床細胞免疫原性研究?；谝呙绲呐R床試驗中全血采集后穩(wěn)定性時長較短的難點，熙寧生物|精翰生物自主研發(fā)了一款全血穩(wěn)定劑，并經(jīng)過全血保存/分離條件的探索和驗證，可將全血分離PBMC前的保存時間延長至48小時，如圖所示，ELISPOT檢測細胞因子分泌結(jié)果無顯著的變化，同時，PBMC放置液氮凍存6個月穩(wěn)定。

此外，由于PBMC穩(wěn)定性較差，且免疫背景較為復雜，使得ELISPOT/ICS的檢測結(jié)果的解析變得極為復雜，甚至很多時候檢測結(jié)果本身也有失真的風險，因此，基于對方法和作用機理的充分理解，熙寧生物|精翰生物通過合理的樣品分組設(shè)計，方法學驗證參數(shù)，以及建立完善的數(shù)據(jù)匯報體系，會對每一個臨床樣品的檢測數(shù)據(jù)進行解讀，充分保證數(shù)據(jù)的真是可靠。

圖3  熙寧生物|精翰生物細胞免疫原性評估和全流程管理

PART 05

熙寧生物|精翰生物具備完善的細胞免疫研究（ELISPOT和ICS）解決方案和數(shù)據(jù)匯報體系，自主開發(fā)的全血穩(wěn)定劑可解決疫苗細胞免疫研究臨床運營痛點，在大樣本項目的管理方面擁有豐富的經(jīng)驗，可提供完善的中心實驗室服務(wù)。

與此同時，熙寧生物|精翰生物具有豐富的疫苗研究和抗傳染病領(lǐng)域研究經(jīng)驗，具有完備的生物分析服務(wù)平臺，支持臨床和臨床前研究，可實現(xiàn)基于配體結(jié)合實驗的結(jié)合抗體檢測，基于活病毒或報告基因的中和抗體檢測，基于ELISPOT和ICS的細胞免疫檢測，以及基于PCR的病毒分型和載量的檢測，覆蓋呼吸道合胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒、破傷風毒素、乙肝病毒和治療性腫瘤疫苗等研究領(lǐng)域。未來，熙寧生物|精翰生物仍將根據(jù)臨床試驗需求繼續(xù)開發(fā)更加準確、靈敏、快捷以及解決臨床運營痛點的檢測方法和解決方案，助力疫苗和抗傳染病領(lǐng)域臨床研究。

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