一、簡(jiǎn)介

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是一種對(duì)細(xì)胞群體中的單個(gè)細(xì)胞或類似細(xì)胞大小的顆粒進(jìn)行快速、連續(xù)檢測(cè)的技術(shù)。其基本原理是：細(xì)胞或其他微粒與相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)蛋白或抗體結(jié)合，基于層流規(guī)律的流體動(dòng)力學(xué)聚焦樣本形成單細(xì)胞流，將單細(xì)胞隊(duì)列快速傳輸至激光光源與液流正交的位置時(shí)，在特定波長(zhǎng)的發(fā)射光源激發(fā)下，形成多角度散射光和細(xì)胞攜帶的各種熒光染料被激發(fā)發(fā)出特征熒光，這些光譜能夠被機(jī)器的信號(hào)接收器接收，通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。儀器收集、測(cè)量眾多單細(xì)胞的散射光和熒光信號(hào)并進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用廣泛，包括細(xì)胞亞群比例及濃度測(cè)定、細(xì)胞功能分型（活化、耗竭、分化時(shí)態(tài)、免疫檢查點(diǎn)等）、細(xì)胞功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞增殖、凋亡、周期、鈣流、殺傷、吞噬功能等）、胞內(nèi)染色（胞內(nèi)因子、核內(nèi)因子、胞內(nèi)活化激酶等）、分泌細(xì)胞因子檢測(cè)（流式液相多重蛋白定量CBA技術(shù)）、微生物學(xué)檢測(cè)（細(xì)菌、真菌、病毒等鑒定，微生物活性等）、表觀遺傳學(xué)相關(guān)檢測(cè)等。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖方法多樣，如相對(duì)計(jì)數(shù)、示蹤染料標(biāo)記、Brdu標(biāo)記、細(xì)胞周期、PCNA、CD71、Ki-67等方法，本文主要介紹一種臨床樣品較為適用的細(xì)胞增殖檢測(cè)方式-Ki-67檢測(cè)細(xì)胞增殖，適用于檢測(cè)的臨床樣本類型豐富，包括新鮮全血、凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）、經(jīng)特殊處理的凍存全血等。

Ki-67檢測(cè)細(xì)胞增殖：

Ki-67抗原是一種與細(xì)胞增殖特異相關(guān)的核抗原，與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)，在處于細(xì)胞周期的活動(dòng)期（G1、S、G2和M期）的增殖細(xì)胞中表達(dá)，在靜止G0期細(xì)胞中不表達(dá)，能夠用于判斷細(xì)胞增殖活性。此外，Ki-67在惡性腫瘤中高表達(dá)在正常細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到，因而逐步成為腫瘤治療中的明星靶點(diǎn)。

基本檢測(cè)原理：使用熒光素偶聯(lián)的抗Ki-67抗體，通過(guò)流式分析Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞的比例，反應(yīng)細(xì)胞增殖強(qiáng)弱。

由于健康人淋巴細(xì)胞亞群中Ki-67表達(dá)較低，直接使用健康人外周血或PBMC不益于方法開發(fā)和驗(yàn)證，本文中提供一種替代的處理方式，即對(duì)健康人樣品使用刺激劑進(jìn)行適當(dāng)刺激活化，獲取Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例相對(duì)較高的樣品用于方法建立。部分臨床試驗(yàn)中使用促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的藥物，發(fā)揮抗腫瘤作用，對(duì)于該作用機(jī)理的方法建立可盡量選用臨床類似的處理方式，如使用臨床試驗(yàn)藥物進(jìn)行樣品的刺激，替代廣譜刺激劑的使用。若驗(yàn)證樣品不能完全模擬臨床樣品處理情況，后續(xù)需使用臨床樣品進(jìn)行部分驗(yàn)證項(xiàng)的確認(rèn)，以確保檢測(cè)方法在臨床樣品中的適用性。

二、常用的標(biāo)本類型和處理方法

1. 人外周血：特殊采血管，適當(dāng)溫度儲(chǔ)存96小時(shí)穩(wěn)定，保存24小時(shí)后，樣品經(jīng)裂紅洗滌等處理后，使用細(xì)胞凍存液凍存，可于-70℃中長(zhǎng)期保存、批量分析。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行凍存處理時(shí)，對(duì)樣品運(yùn)輸時(shí)效要求相對(duì)較高；臨床中心具備相關(guān)處理能力時(shí)，可節(jié)省運(yùn)輸成本。

2. 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)：抗凝全血，分離PBMC，使用新鮮細(xì)胞進(jìn)行分析或者采用合適的凍存液將細(xì)胞在-70℃或者液氮凍存，復(fù)蘇后進(jìn)行試驗(yàn)。臨床中心需具備分離PBMC能力。

3. 精翰生物自主開發(fā)的定制采血管，樣品采集后適當(dāng)溫度保存一定時(shí)間，可直接將樣品儲(chǔ)存于-70℃進(jìn)行長(zhǎng)期保存，無(wú)需凍存操作、無(wú)需程序降溫。使用該方法可節(jié)省臨床中心操作便捷性，同時(shí)，可實(shí)現(xiàn)批量運(yùn)輸、批量檢測(cè)，節(jié)省項(xiàng)目成本。

三、實(shí)驗(yàn)流程

本文闡釋通用型方法驗(yàn)證相關(guān)實(shí)驗(yàn)流程，即使用刺激PBMC進(jìn)行Ki-67相關(guān)檢測(cè)流程。

1) 采購(gòu)的新鮮PBMC，使用廣譜刺激劑刺激特定時(shí)間以獲取Ki-67陽(yáng)性比例合適的樣品。

2) 刺激完成，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至采血管中，適當(dāng)溫度保存。

3) 保存適當(dāng)時(shí)間，可直接用于檢測(cè)或取出適當(dāng)體積放于-70℃凍存，長(zhǎng)期保存。

4) 細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管或者微孔板（對(duì)于凍存保存樣品需進(jìn)行復(fù)蘇預(yù)處理），封閉液封閉，表面抗體孵育。

5) 固定破膜，封閉液封閉

6) 胞內(nèi)/核內(nèi)抗體孵育。

7) 上機(jī)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)流程圖解析

四、精翰生物部分測(cè)試數(shù)據(jù)展示

1. 刺激劑刺激不同時(shí)間Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例變化

2. 設(shè)置的溫度保存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)（PBMC刺激48小時(shí)）

備注：以上僅為某個(gè)方法開發(fā)數(shù)據(jù)舉例，在不同細(xì)胞亞群中穩(wěn)定性結(jié)果有差別，某些項(xiàng)目亞群中Ki-67指標(biāo)驗(yàn)證至96h穩(wěn)定性。

Ki-67分群效果圖展示（對(duì)應(yīng)表格中Baseline-DT樣品）：

3. -70℃保存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)（PBMC刺激96小時(shí)）

備注：更長(zhǎng)時(shí)間的凍存穩(wěn)定性待測(cè)試。

五、應(yīng)用

1) 作為癌癥治療的預(yù)后指標(biāo)：越來(lái)越多臨床研究表明Ki-67可以作為癌癥治療預(yù)后評(píng)估的潛在指標(biāo)，作為預(yù)后判斷金標(biāo)準(zhǔn)，10-14%陽(yáng)性比例提示有較高的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。

2) 作為癌癥治療的潛在靶點(diǎn)：基于Ki-67在惡性腫瘤中的高表達(dá)而在正常細(xì)胞中低表達(dá)特性，預(yù)示著其可能作為癌癥治療潛在靶標(biāo)。潛在治療方式包括Ki-67反義核苷酸，anti-Ki-67多肽核苷酸（peptide nucleic acid, PNAS），靶向Ki-67的RNA干擾技術(shù)，溶瘤病毒介導(dǎo)的Ki-67-siRNA，抑制Ki-67啟動(dòng)子激活的基因治療等。

3) 作為免疫細(xì)胞激活的潛在靶標(biāo)：在抗腫瘤藥物作用機(jī)理中，部分藥物可激活機(jī)體免疫細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤活性，對(duì)免疫細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合臨床給藥前患者基線表達(dá)情況，可用于評(píng)估藥物對(duì)免疫細(xì)胞激活情況。

參考文獻(xiàn)：

1、 流式細(xì)胞術(shù)-原理、操作及應(yīng)用，陳朱波、曹雪濤著，科學(xué)出版社出版。

2、 Ki67 targeted strategies for cancer therapy, C. Yang, J. Zhang, M. Ding, et al. :DOI 10.1007/s12094-017-1774-3.