前言

基因治療的概念是在20世紀(jì)70年代初提出來的，最初的概念是引入一個(gè)正常的基因來取代一個(gè)突變基因，雖然現(xiàn)在有更多的替代方法，如基因編輯和堿基編輯，但它仍然是精翰生物高度依賴的主要策略之一。

基因治療按照基因?qū)牒蟮募?xì)胞培養(yǎng)模式可以分為“離體治療”和“體內(nèi)治療”?！半x體治療”的操作對象是從病人身上分離的細(xì)胞，然后在體外經(jīng)過改造和擴(kuò)增再回輸?shù)襟w內(nèi)達(dá)到治療的效果，例如CAR-T治療等?！绑w內(nèi)治療”操作時(shí)只需要把攜帶目的基因的病毒載體注入病變部位即可，理論上可以實(shí)現(xiàn)任意種類細(xì)胞的基因改造，不再像“離體治療”那樣受到細(xì)胞種類的限制，這是“體內(nèi)治療”相對“離體治療”最大的優(yōu)勢，但在技術(shù)上真正實(shí)現(xiàn)任意細(xì)胞的基因改造目前還有一定難度，例如AAV病毒載體基因治療。此外，“體內(nèi)治療”也省去了“離體治療”的細(xì)胞收集、基因改造、培養(yǎng)擴(kuò)增等繁瑣的操作。

以AAV為載體的基因治療藥物在產(chǎn)品CMC階段、臨床前和臨床階段都會用到各種各樣的生物分析手段。不同技術(shù)平臺對AAV為載體的基因治療藥物提供了不同解決方案。

難點(diǎn)分析1：AAV基因治療產(chǎn)品在CMC階段需要考察多種質(zhì)量屬性，包括鑒別、含量/效價(jià)、純度、雜質(zhì)和安全性等多個(gè)方面。其中，含量和效價(jià)是最大的難點(diǎn)。精翰生物團(tuán)隊(duì)對基因組滴度、感染性實(shí)驗(yàn)都具有豐富經(jīng)驗(yàn)。尤其在病毒滴度方面，開發(fā)出針對多種血清型的AAV基因組拷貝數(shù)滴度的定量檢測方案，滿足滴度測定的同時(shí)，也能考察病毒完整性。

精翰生物利用Naica數(shù)字PCR技術(shù)對重組腺相關(guān)病毒(rAAV)質(zhì)粒載體和病毒基因組中ITR（CY5標(biāo)記）、目的基因（GOI，HEX標(biāo)記）和轉(zhuǎn)錄相關(guān)調(diào)控元件WPRE（FAM標(biāo)記）三個(gè)不同基因位點(diǎn)同時(shí)拷貝數(shù)定量的方法進(jìn)行優(yōu)化，在數(shù)據(jù)分析中對不同病毒樣品的前處理方案的條件進(jìn)行闡述和比較，發(fā)現(xiàn)病毒樣品的前處理方案中ITR發(fā)卡結(jié)構(gòu)的線性化和衣殼蛋白的裂解條件對病毒基因組拷貝數(shù)定量的精確性影響尤為重要，為數(shù)字PCR方法在基因治療病毒載體的質(zhì)量控制體系中建立標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法提供依據(jù)。

Fig1、cdPCR檢測WPRE/GOI/ITR 三靶標(biāo)1D散點(diǎn)圖

A圖顯示W(wǎng)PRE檢測的1D散點(diǎn)圖，B圖顯示GOI檢測的1D散點(diǎn)圖，C圖顯示Msp I酶切處理前ITR檢測的1D散點(diǎn)圖，D圖顯示Msp I酶切處理后ITR檢測的1D散點(diǎn)圖，藍(lán)色表示W(wǎng)PRE陽性微滴群，綠色表示EGFP陽性微滴群，紅色表示ITR陽性微滴群，灰色表示陰性微滴群。當(dāng)WPRE或GOI比ITR越接近1：2，則產(chǎn)品的基因組更完整。

難點(diǎn)分析2：AAV基因治療在臨床前的組織分布和臨床階段的脫落研究?；谒幬镞M(jìn)入體內(nèi)后會進(jìn)入各器官，根據(jù)作用機(jī)理和治療目的，在臨床前研究組織分布，可以預(yù)測藥物安全性，并指導(dǎo)臨床方案。臨床階段的脫落分析將通過對患者給藥后的排泄物進(jìn)行測定。通常會包括熒光定量PCR反應(yīng)和傳染性試驗(yàn)開展。

精翰生物具有多款基因治療藥物，包括溶瘤病毒和不同血清型AAV基因治療藥物的臨床前組織分布和臨床階段脫落研究經(jīng)驗(yàn)。使用熒光定量PCR開展這兩項(xiàng)檢測時(shí)，需要合成特異性強(qiáng)和靈敏度高的引物和探針。多種組織樣品和代謝物樣品的DNA提取過程中可能會引物一些PCR抑制物，抽提過程中產(chǎn)物量的差異性都需考量。

Fig2、精翰生物在PK/脫落研究中的流程圖

難點(diǎn)分析3：免疫原性是影響AAV基因治療產(chǎn)品安全性和有效性的重要因素。AAV基因治療在免疫原性的評估過程中不僅需要考慮體液免疫，還需要考慮細(xì)胞免疫。體液免疫檢測內(nèi)容可以為：抗衣殼蛋白抗體/中和抗體和抗表達(dá)產(chǎn)物抗體。使用的分析方法通常為LBA或者cell based assay。細(xì)胞免疫檢測內(nèi)容可以為：針對衣殼蛋白T細(xì)胞應(yīng)答或針對表達(dá)產(chǎn)物抗體T細(xì)胞應(yīng)答。無論是體液免疫還是細(xì)胞免疫，精翰生物擁有不同策略所開發(fā)的方法學(xué)和檢測設(shè)備。同時(shí)利用完善的方法學(xué)可以開展在臨床前研發(fā)階段，AAV衣殼蛋白改造后臨床前免疫原性評估。

精翰生物使用ELISPOT平臺，已經(jīng)開發(fā)和驗(yàn)證了基于ELISPOT技術(shù)檢測人PBMC經(jīng)CEF刺激后分泌IFN-γ的免疫細(xì)胞數(shù)的方法學(xué)，建立了較為完善的方法學(xué)開發(fā)驗(yàn)證體系。同時(shí)，正在開展了不同血清型AAV刺激PBMC后分泌INF-γ的免疫細(xì)胞數(shù)的方法學(xué)開發(fā)工作，根據(jù)AAV病毒載體血清型的不同，設(shè)計(jì)更具特異性方法學(xué)開發(fā)路徑和驗(yàn)證方案。

Fig3、精翰生物在ELISPOT細(xì)胞免疫上的應(yīng)用

1.選擇合適的刺激物和免疫細(xì)胞（PBMC, B細(xì)胞, T細(xì)胞）作用加入ELISPOT板中。2. 培養(yǎng)孵育一段時(shí)間，使激活的免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。3. ELISPOT板已包被抗細(xì)胞因子的抗體，可以捕獲在激活的免疫細(xì)胞周圍分泌細(xì)胞因子。4.洗板去除細(xì)胞，加入二抗反應(yīng)，酶聯(lián)顯色，激活的免疫細(xì)胞會形成較為規(guī)則的圓形斑點(diǎn)。

精翰生物擁有不同檢測平臺和技術(shù)手段，2022年中，熙寧I精翰搭建起了二代測序平臺。精翰生物擁有設(shè)計(jì)合理、設(shè)施完備的獨(dú)立的高通量測序?qū)嶒?yàn)室。實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)遵循高通量測序的具體檢測流程和防治污染的原理。實(shí)驗(yàn)包括一個(gè)專用走廊，分區(qū)設(shè)計(jì)依次為試劑準(zhǔn)備間、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增一區(qū)、雜交捕獲區(qū)/擴(kuò)增二區(qū)、測序間和電泳間。實(shí)驗(yàn)室設(shè)備齊全且經(jīng)過合理驗(yàn)證，目前實(shí)驗(yàn)室儀器有TC-96/G/H(b)B（基因擴(kuò)增儀）、QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument （QuantStudioTM 5實(shí)時(shí)定量PCR儀）、Agilent 4150（片段分析儀）、Covaris M220（核酸打斷儀）、E-Gel Power Snap（凝膠電泳系統(tǒng)）、Qubit（熒光計(jì)）、NanoPhotometer N60 Touch（超微量分光光度計(jì)）等，全面滿足高通量測序?qū)嶒?yàn)需求。也為AAV基因治療藥物在CMC、臨床前和臨床階段提供了更完善的服務(wù)需求。