寡核苷酸藥物（Oligonucleotide）是一類由幾十個核苷酸組成的，序列較短的核酸分子。其主要是通過基因沉默抑制靶蛋白的表達從而實現(xiàn)治療疾病的目的。與傳統(tǒng)藥物相比，RNA靶向藥物具有多重技術優(yōu)勢，包括：（1）靶向特異性強；（2）高效性；（3）藥物作用長效；（4）藥物設計簡便，研發(fā)周期短，臨床轉化與研發(fā)成功率較高；（5）候選靶點豐富，適應癥分布廣等。目前人工合成的寡核苷酸藥物分類如圖1所示。其中反義寡核苷酸（ASOs）、小干擾 RNA（siRNA）為臨床中開發(fā)的RNA靶向藥物的主要形式。全球首款反義核酸藥物于1998年獲批上市，開啟RNA靶向藥物上市的征程；全球首款siRNA藥物Patisiran于2018年獲批上市，更具有里程碑意義，近兩年來已有四款siRNA藥物陸續(xù)獲批上市。截止2021年，據(jù)統(tǒng)計全球已有十五款RNA靶向藥物獲批上市如圖2，有超過400個化合物處于研發(fā)階段。除Spinraza作為孤兒藥在中國獲批上市外，暫時尚無其他產(chǎn)品在國內上市。

圖1

圖2

寡核苷酸生物分析

目前寡核苷酸生物分析方法主要有HPLC、LC-MS、ELISA、RT-qPCR等，本文主要介紹基于LC-MS在寡核苷酸藥物生物分析中的應用。

1）樣品前處理

在生物基質中，含有復雜的成分包括蛋白質，磷脂，大量鹽類以及其他有機和無機物質等，在使用LC-MS進行檢測會產(chǎn)生比較明顯的基質效應。此外寡核苷酸藥物經(jīng)過修飾后，有較高的血漿蛋白結合率，因此在樣品預處理階段去除生物樣品中的鹽和蛋白質對于LC-MS分析的順利進行顯得至關重要。一般寡核苷酸樣品前處理主要包括蛋白質沉淀（PPT），液液萃?。↙LE）和固相萃?。⊿PE）。PPT雖然操作簡單迅速，成本低，但由于回收率低，明顯的基質效應，所以基本上不采用這種方式進行前處理。一般采用LLE或者SPE，或者LLE和SPE聯(lián)合使用，可以獲得較高的回收率，同時降低基質效應的影響。

LLE在寡核苷酸提取過程中屬于常用的一種提取方式，比較常用的萃取劑為苯酚-氯仿，在此基礎上也可以進行優(yōu)化，比如加入異丙醇可以進行沉淀，去除基質中蛋白降低基質效應。同時也需要根據(jù)化合物性質，調節(jié)pH值，比如加入氨水等，來提高寡核苷酸藥物在水相中的溶解性。另外還可以使用RNA提取試劑Trizol來提取RNA，提取過程如圖3所示。

圖3

SPE是提取寡核苷酸藥物使用最廣泛的處理方式。固相萃取的方法與色譜分離的原理相同，由于寡核苷酸藥物極性很大，保留差，在在固相小柱活化和淋洗的過程中均需要使用離子對試劑緩沖液才能達到保留寡核苷酸和洗脫干擾基質的目的。此外目前市面上也有非常成熟的提取寡核苷藥物的試劑盒，例如Clarity?OTX?萃取方案可有效去除掩蓋目標寡核苷酸并影響分析結果的細胞碎片，包括蛋白質、基因組DNA和脂質。通過去除這些污染物，MS基線噪音可顯著降低，從而簡化定量生物分析的過程。SPE前處理示意圖如圖4所示。

圖4

此外寡核苷酸在聚丙烯管和玻璃容器中均存在非特異性吸附，這嚴重影響檢測重現(xiàn)性和準確度，因此可以加入表面活性劑或者容器烷基化來降低或者消除這一影響。

2）色譜分離

寡核苷酸屬于酸性強極性化合，在一般色譜柱上很難保留。針對寡核苷酸色譜法主要有離子對反相色譜（IP-RPLC）、離子交換色譜（IEC）、親水作用色譜（HILIC）。其中離子對反相色譜法最為常用，如圖5所示離子對試劑增強寡核苷酸在反相色譜上的保留原理主要基于兩點：首先，帶正電的離子對試劑會與帶負電的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中構成離子對，減少了寡核苷酸的凈電荷并增加了其疏水性，此時疏水相互作用促成了寡核苷酸在離子對反相色譜中的保留；再者，離子對試劑依靠其疏水性烷基鏈可以吸附于反相色譜的固定相上以形成離子交換劑（Ion exchanger），此時靜電相互作用將幫助寡核苷酸在反相色譜中的保留。

離子對試劑的種類繁多，最常用離子對主要為基于乙酸胺試劑和基于六氟異丙醇（HFIP）的胺類離子對試劑?，F(xiàn)如今，基于 HFIP的離子對試劑較基于乙酸的離子更為常用， 這是因為與乙酸相比，HFIP的沸點和酸性更弱，這意味著 HFIP 在電噴霧離子化的氣相狀態(tài)下更容易揮發(fā)，對寡核苷酸的離子化干擾更小，與電噴霧質譜更兼容。常見的離子對試劑主要有三乙胺（TEA）、醋酸三乙胺（TEAA）、碳酸三乙胺（TEAB）、六氟異丙醇（HFIP）。如圖6整理一些關于用于反義寡核苷酸的色譜方法參數(shù)。

圖5

（The Separation and Analysis of Oligonucleotides by Mass Spectrometry，2019）

圖6

（The Separation and Analysis of Oligonucleotides by Mass Spectrometry，2019）

3）質譜檢測

寡核苷酸由于其特殊結構，其每個磷酸二酯鍵上都帶有1個酸性質子（PKa~1），這類化合物在ESI源負離子模式下響應較好。由于寡核苷酸含有多個核苷酸基團，在ESI源中發(fā)生去質子反應，在負離子模式下形成多重電荷離子，同時很容易結合金屬離子，因此會分散質譜信號。此外隨著寡核苷酸分子量增加其檢測響應損失嚴重。因此對這類化合物需要優(yōu)化質譜條件，改善多電荷分布，同時減少待測物在質譜分析加合離子形成。主要通過調節(jié)溶液pH值，陽離子濃度和有機溶劑組成來消除或者降低上述因素的影響。在色譜分離中已經(jīng)提及需要使用到離子對試劑，在一開始方法開發(fā)階段，尋找子母離子也必須使用離子對試劑，否則很難找到對應的子母離子碎片，同時基于此條件下再進行質譜參數(shù)的優(yōu)化，可能會獲得比較好的信號響應。

結束語

由于寡核苷酸藥物適應癥涵蓋范圍廣，包括腫瘤、罕見?。∥s性脊 髓側索硬化、杜氏肌營養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮）、病毒性疾病、腎臟疾病、心血管 疾?。δ懿蛔?、血脂異常等）、炎癥類疾?。ㄏ?、關節(jié)炎、結腸炎）、代謝類疾?。ㄌ悄虿?、非酒精性脂肪性肝炎）等，有望掀起繼小分子化藥，抗體藥物之后第三次新藥研發(fā)浪潮。雖然其在生物分析方面存在諸多挑戰(zhàn)，但熙寧生物擁有專業(yè)的質譜團隊，能夠為客戶提供各種解決方案，切實解決分析中的各種難題，為新藥研發(fā)貢獻一份力量。