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作為治療胃癌、食管癌和胰腺癌等消化道腫瘤的明星靶點(diǎn)，CLDN18.2(claudin18.2)吸引了眾多制藥企業(yè)競相布局，成為繼PD1/PD-L1之后另一個抗腫瘤生物藥開發(fā)的風(fēng)口。這里，我們通過總結(jié)CLDN18.2的蛋白結(jié)構(gòu)，組織表達(dá)及藥物臨床相關(guān)信息，尤其是免疫組化檢測的cutoff值設(shè)定，希望能為廣大同行帶來一些啟發(fā)和幫助。

CLDN18基因與蛋白表達(dá)

CLDN18 是CLDN家族的成員，在細(xì)胞間緊密連接中起主要作用，編碼基因長達(dá)35Kb，位于3號染色體3q21-23區(qū)域。該基因以可變剪接的形式轉(zhuǎn)錄出兩種mRNA，進(jìn)而翻譯出兩種蛋白（圖1）。CLDN18.1 和CLDN18.2高度同源，氨基酸序列相似度約為92%，其差異僅存在N端第一個外顯子，CLDN18.1使用的是1a外顯子，CLDN18.2用的是1b外顯子1。然而，可用于藥物開發(fā)和診斷檢測的第一胞外環(huán)（ECL1）的55個氨基酸中僅存在8處差異2，相似度非常高。同時，CLDN18.2作為膜蛋白，胞外區(qū)較短，這新藥開發(fā)和診斷抗體開發(fā)工作帶來了較大的挑戰(zhàn)。

圖1 CLDN18.1（上）與CLDN18.2（下）的可變剪切

CLDN18蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)高度的組織特異性。正常組織中，Claudin18.1僅表達(dá)于肺部，CLDN18.2僅在胃粘膜已分化的上皮細(xì)胞表達(dá)，其他組織均無表達(dá)2（圖2）；該特征為CLDN18.2成為潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)奠定了非常好的基礎(chǔ)，有助于降低藥物的非腫瘤靶向的毒性（on-target off-tumor toxicities）。

圖2 Claudin18.1(CLDN18.1)與CLDN18.2(CLDN18.2)在正常組織中的分布（mRNA水平）

總之，在正常生理狀態(tài)下CLDN18.2僅在埋藏于胃粘膜上已分化的上皮細(xì)胞中表達(dá)，正常組織中的單抗基本上接觸不到。然而，當(dāng)惡性腫瘤發(fā)生后，原本的緊密連接破壞，使腫瘤細(xì)胞表面的CLDN18.2表位暴露出來。當(dāng)組織癌變后， CLDN18.1的表達(dá)未見明顯變化，CLDN18.2則出現(xiàn)異常激活，高度選擇性表達(dá)于胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌等。據(jù)文獻(xiàn)披露，CLDN18.2表達(dá)發(fā)現(xiàn)于38%~87%胃癌3,4,5,6,7、20%~59%胰腺癌5、18%食管癌8和3%非小細(xì)胞肺癌9。對于晚期轉(zhuǎn)移性胃癌，HER2陽性率不足20%4。相對廣泛的腫瘤特異性膜表達(dá)，使之成為較為理想的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)和潛在的伴隨診斷開發(fā)生物標(biāo)志物。當(dāng)然，藥物開發(fā)過程中為了降低毒副作用，有效規(guī)避與CLDN18.1的交叉反應(yīng)也是必不可少的。對于診斷抗體而言，特異性結(jié)合 CLDN18.2而不與CLDN18.1結(jié)合是精準(zhǔn)地指導(dǎo)患者篩選的基本要求。

CLDN18.2藥物臨床進(jìn)展及診斷cutoff值

目前，全球約有60款在研CLDN18.2藥物，除單克隆抗體外，嵌合抗原受體T細(xì)胞治療（CAR-T）、雙特異性抗體，抗體偶聯(lián)藥物（ADC）和mRNA療法等也成為CLDN18.2新的治療方向。

單克隆抗體相關(guān)藥物

單抗領(lǐng)域是CLDN18.2藥物進(jìn)展最快的領(lǐng)域。相關(guān)免疫組化檢測的信息也是最多。進(jìn)展最快的是安斯泰來的Zolbetuximab。在該藥的臨床中，影響比較大的主要是Mono研究和FAST研究。研究人員為確定目標(biāo)人群的CLDN18.2表達(dá)的cutoff值，進(jìn)行了不懈探索，可以為后來者提供一定的參考。

Mono研究

在Mono研究(NCT01197885）中，經(jīng)過篩選，從268名患者中選擇了54 位≥50% 腫瘤細(xì)胞中等或強(qiáng)表達(dá)CLDN18.2的患者入組。結(jié)果顯示，總體客觀緩解率(ORR)為 9%，達(dá)到SD（Stable disease） 的患者為 14%。然而，在≥70% 腫瘤細(xì)胞中等或強(qiáng)表達(dá) CLDN18.2 的患者中，ORR值更高， 為14%，SD的比例也上升到17%。由此可見，CLDN18.2單抗對于CLDN18.2高表達(dá)人群顯示更好的療效（圖3）10。該試驗(yàn)中使用的IHC抗體是來自Zymed的抗CLDN18.2的兔多抗，結(jié)果的可重復(fù)性較差。同時，鑒于該研究只是一個單臂試驗(yàn)，入組人數(shù)也有限，且ORR值并不高，后續(xù)需要更多的臨床研究和改進(jìn)。不可否認(rèn)的是Mono研究初步確定了Zolbetuximab后續(xù)臨床試驗(yàn)的cutoff值為70%。

圖3 Mono研究中腫瘤體積變化。A：CLDN18.2染色細(xì)胞比例<70%，B：CLDN18.2染色細(xì)胞比例≥70%

FAST研究

2021年2月，Ann Oncol發(fā)表Ⅱb期臨床試驗(yàn)FAST研究（NCT01630083）的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為外界披露了單克隆抗體Zolbetuximab進(jìn)一步的數(shù)據(jù)。考慮到MONO研究單藥治療相對較低的反應(yīng)率，F(xiàn)AST研究采用了Zolbetuximab聯(lián)合化療(EOX)的治療方案。同時，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，CLDN18.2 的cutoff值，選擇了≥40% 腫瘤細(xì)胞中等或強(qiáng)表達(dá) CLDN18.2為入組條件。檢測方法使用的是CLAUDETECT?18.2 immunohistochemistry assay [Ganymed, Germany]，克隆號為43-14A。該抗體實(shí)質(zhì)上是一個既能識別CLDN18.1也能識別CLDN18.2的抗體，特異性較低。結(jié)果顯示，Zolbetuximab 聯(lián)合化療相對與單獨(dú)化療顯著改善了mPFS（7.5 vs 5.3 個月）和mOS（13.0 vs 8.3個月）。在探索性分析的過程中，高表達(dá)組，即≥70%腫瘤細(xì)胞CLDN18.2陽性患者的mPFS長達(dá)9個月，mOS更是達(dá)到了16.5個月，甚至優(yōu)于曲妥珠聯(lián)合化療的13.8個月的mOS，而40-69%腫瘤細(xì)胞CLDN18.2陽性患者的mPFS和mOS在Zolbetuximab 聯(lián)合化療的情況下與單獨(dú)化療沒有顯著性差異（圖4）。該結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了70%的cutoff值6。

圖4 FAST研究中PFS和OS變化  

總體PFS和OS（A,D），≥70%腫瘤細(xì)胞CLDN18.2陽性PFS和OS（B,E）和40-69%腫瘤細(xì)胞CLDN18.2陽性PFS和OS（C,F）

SPOTLIGHT研究和GLOW研究

基于前期研究，基本明確了以70%腫瘤染色比例作為cutoff值。然而，在III期試驗(yàn)SPOTLIGHT(NCT03504397)和GLOW（NCT03653507）中，研究人員將Cutoff值改成了75%（檢測抗體克隆號仍為43-14A）。主要是因?yàn)镮HC方法從原來的手工方法改為Ventana自動化平臺方法。據(jù)文獻(xiàn)提示，自動化平臺中75%腫瘤細(xì)胞陽性等效于原手工方法的70%陽性11。自動化平臺方法的使用使得檢測過程更加穩(wěn)定，結(jié)果判讀更加可靠。至此，基本確認(rèn)了基于Ventana平臺的>75%腫瘤細(xì)胞CLDN18.2中等或強(qiáng)表達(dá)為最終的cutoff值（表1）。

表1  Zolbetuximab相關(guān)的主要臨床試驗(yàn)

除此之外，創(chuàng)勝的CLDN18.2單抗（TST001）在I期臨床試驗(yàn)（NCT04495296）中采用了≥40% 腫瘤細(xì)胞中等或強(qiáng)表達(dá) CLDN18.2為入組條件，后期可能會根據(jù)臨床試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，確定最終的cutoff值11。

除此之外，國內(nèi)外眾多藥企也在CLDN18.2單抗的道路上奮起直追，大多采用的是CLDN18.2陽性作為入組條件進(jìn)行探索，由于公開披露的信息有限，具體的檢測策略暫不做詳述。

CAR-T相關(guān)藥物

根據(jù)PD-1藥物的經(jīng)驗(yàn)，不同的藥物的伴隨診斷檢測有著不同的cutoff值。若是不同類型的藥物，cutoff值的確定也需要結(jié)合臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行探索。在CLDN18.2 CAR-T領(lǐng)域，科濟(jì)公司目前是走在全球領(lǐng)先地位的。

CT041是科濟(jì)藥業(yè)開發(fā)針對CLDN18.2靶點(diǎn)的全球首款CAR-T產(chǎn)品，用于治療CLDN18.2陽性實(shí)體瘤。在Ⅰb期臨床研究中，采用的cutoff值為≥10%的腫瘤細(xì)胞claudin18.2表達(dá)，染色強(qiáng)度≥1+。盡管相比于單抗藥物，該試驗(yàn)采用了比較保守的cutoff值，但CT041仍表現(xiàn)出較好的治療結(jié)果（圖5），其中針對所有患者ORR達(dá)到48.6%(95% CI, 31.9-65.6)，DCR為73.0%；針對胃癌患者ORR達(dá)到57.1% (95% CI, 37.2-75.5)。在亞組分析的過程中，在不同CLDN18.2表達(dá)水平的亞組中（低表達(dá)，中表達(dá)和高表達(dá)），ORR相當(dāng)（表2）。這表明對于CAR-T藥物CT041，在CLDN18.2表達(dá)不高的患者都能起到較好的治療效果，這無疑增加了潛在的獲益人群，也為后期的cutoff值確定奠定了基礎(chǔ)13。鑒于前期的良好數(shù)據(jù)，目前該藥物已啟動Ⅱ期試驗(yàn)，并完成了首例患者入組，具體cutoff值信息暫未披露，估計(jì)不會有大的變化。

 圖5 CT041治療后的情況變化

表2 CT041治療后胃癌不同claudin18.2表達(dá)狀態(tài)下的ORR

LB-1904是由傳奇生物開發(fā)，靶向CLDN18.2的CAR-T細(xì)胞療法。目前已經(jīng)進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)，用于治療CLDN18. 2陽性的胃癌或胰腺癌。根據(jù)公開的信息，CLDN18.2陽性并未詳細(xì)定義，這里就不詳述了。除CT041和LB-1904外，國內(nèi)公司北恒生物、隆耀生物和凱地生物也布局了相關(guān)CAR-T產(chǎn)品，靶向治療實(shí)體瘤或消化道腫瘤，期待能有更好的結(jié)果出現(xiàn)。

ADC

2021年6月，石藥集團(tuán)發(fā)布公告， 經(jīng)NMPA批準(zhǔn)，其ADC藥物SYSA1801獲批臨床研究（NCT05009966），在劑量爬坡階段采用的是IHC ≥ 1+，劑量擴(kuò)展階段采用的也是類似FAST研究中≥40% 腫瘤細(xì)胞IHC ≥ 2+ CLDN18.2表達(dá)為入組條件14。

康諾亞公司CMG901 為首個在中國及美國取得臨床試驗(yàn)申請的CLDN18.2 ADC。2021年3月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)CMG901進(jìn)行G/GEJ癌I期臨床試驗(yàn)的申請（NCT04805307）,該試驗(yàn)計(jì)劃入組162名已知CLDN18.2狀態(tài)的患者，評價CMG901的安全性、耐受性、藥代動力學(xué)和抗腫瘤活性，即并不要求患者CLDN18.2是陽性，估計(jì)會在不同的亞組中對CLDN18.2的表達(dá)狀態(tài)有要求。

榮昌生物RC118 于2021年7月19日向NMPA提交RC118在國內(nèi)的臨床試驗(yàn)申請，目前已獲批臨床。2021年11月完成澳大利亞Ⅰ期臨床研究首例患者給藥。此外，恒瑞醫(yī)藥、君實(shí)生物和科倫藥業(yè)等也布局了CLDN18.2 ADC產(chǎn)品管線。

雙特異抗體藥物

雙抗藥物方向，AMG-910進(jìn)度最快。AMG-910是安進(jìn)（Amgen）和百濟(jì)神州聯(lián)合開發(fā)的CD3/CLDN18.2雙特異性抗體，也是首個在我國申報(bào)臨床的CLDN18.2雙抗。AMG-910采用HLE-BiTE技術(shù)，延長藥物半衰期，通過與腫瘤細(xì)胞CLDN18.2和T細(xì)胞CD3結(jié)合，招募T細(xì)胞定向殺傷腫瘤細(xì)胞。2020年7月1日獲得CDE的臨床試驗(yàn)受理。目前正在開展的Ⅰ期臨床研究（NCT04260191），旨在評估AMG 910治療CLDN 18.2陽性的G/GEJ腺癌患者的安全性、耐受性、藥代動力學(xué)和療效。

繼AMG-910之后，國內(nèi)啟愈生物Q-1802（PD-L1/CLDN18.2雙抗）、天鏡生物ABL111（4-1BB/CLDN18.2雙抗）、普米斯PM1032（4-1BB/Claudin18.2雙抗）也先后獲批臨床。

總結(jié)

目前針對CLDN18.2靶點(diǎn)的生物藥層出不窮，入組cutoff值也不盡相同。安斯泰來的Zolbetuximab通過Mono研究和FAST研究基本確定了CLDN18.2陽性腫瘤細(xì)胞占比≥75%，染色強(qiáng)度≥2+為cutoff值。后續(xù)的研發(fā)企業(yè)都還在cutoff值探索階段。如科濟(jì)的CT041采用claudin18.2陽性腫瘤細(xì)胞占比≥10%，染色強(qiáng)度≥+為入組條件；石藥集團(tuán)的SYSA1801在劑量爬坡階段采用的是IHC ≥ +，劑量擴(kuò)展階段采用≥40% 腫瘤細(xì)胞CLDN18.2表達(dá)≥ 2+為入組條件；其他廠家在探索的時候大多采用CLDN18.2陽性入組；個別廠家采用CLDN18.2陰陽性均可入組?？紤]不同的藥物作用機(jī)制和有效性不同，cutoff值可能不同。同類產(chǎn)品的cutoff值設(shè)定雖然有一定的參考性，但是免疫組化檢測的cutoff值影響因素較多，如藥物類型，藥效，診斷抗體特異性以及檢測平臺的穩(wěn)定性等都是重要的影響因素，重要的是結(jié)合具體產(chǎn)品的作用機(jī)制和實(shí)際的有效性結(jié)果選擇適合的檢測。

為此，參考公開的文章及主要臨床試驗(yàn)，基于當(dāng)前最穩(wěn)定的Ventana免疫組化自動染色平臺，熙寧生物建立了CLDN18.2免疫組化的檢測方法(圖6)，可為廣大客戶提供穩(wěn)定高效的臨床試驗(yàn)階段樣本檢測服務(wù)，歡迎垂詢。

圖片待補(bǔ)充

圖6  免疫組化法檢測腫瘤中CLDN18.2表達(dá)結(jié)果示例

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