免疫檢查點抑制劑成功用于腫瘤疾病的治療，刺激了廣泛的針對免疫調(diào)節(jié)靶點的研究熱情，包括針對T細(xì)胞共刺激受體的激動劑，例如OX40，4-1BB，GITR , ICOS等靶點。與免疫檢查點抑制劑，需要對靶點完全和持續(xù)的受體占位率才能最大程度的發(fā)揮藥效不同，對于免疫檢查點激動劑類藥物，什么才是最佳給藥方案？多少的受體占有率才能發(fā)揮最大藥效？這些都有待于更多的研究。

眾所周知，對于免疫檢查點抑制劑，PD-1，PD-L1，TIGIT等靶點，受體占位率的研究是臨床PD研究的標(biāo)準(zhǔn)配置之一。更多關(guān)于受體占有率檢測的背景信息，請參考熙寧/精翰微信公眾號平臺，熙寧小課系列：基于流式細(xì)胞術(shù)的大分子藥物受體占位研究。

為了解決臨床研究過程中，臨床中心分離PBMC耗時耗力，需要配置相關(guān)設(shè)備和人員的矛盾；為了解決隨采集隨運輸?shù)母哌\費，隨到隨檢的高檢測費用，精翰生物經(jīng)過不懈的努力，開發(fā)并驗證了基于凍存外周血全血的實驗方案，并在包括PD-1，PD-L1，TIGIT，CD19, CD20, CD73 等一系列靶點上進(jìn)行了驗證，成功用于臨床樣品的分析，極大的方便了臨床樣品采集和并減少了樣品分析的費用。更多的信息，請請參考熙寧/精翰微信公眾號平臺，熙寧小課系列：大分子受體占位檢測，使用凍存全血，您想嘗試一下嗎？

對于免疫檢查點激動劑，遠(yuǎn)比抑制劑要復(fù)雜的多，本文以O(shè)X40靶點為例，分享BMS-986178臨床前和臨床的一系列研究，與諸位同行探討單抗類激動劑藥物，應(yīng)該如何進(jìn)行哪些轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究，助力藥物的開發(fā)。

根據(jù)激動劑類藥物的作用過程和機制，可以作為PD指標(biāo)的檢測主要包括：

一、受體激動劑類的單抗與靶點結(jié)合（受體占位率的檢測）；抗體與靶點結(jié)合后，可能引起靶點表達(dá)水平的調(diào)節(jié)（靶點在細(xì)胞表面的表達(dá)水平）；

如圖1的 A所示，測試了OX40在第8天和第13天，單獨給藥以及與PD-1聯(lián)合給藥，三個不同的劑量下（0.03，0.3，3 mg/kg）在外周血和腫瘤Treg亞群上的受體占有率，可以看到隨著給藥劑量的增加，受體占位率增加，第13天與第8天相比，受體占有率有不同程度的降低；如圖1 的B和C所示，與PD-1聯(lián)合給藥的兩個不同的劑量下（0.5，5 mg/kg），在第10天，第17天和第23天的OX40受體占有率和OX40的表達(dá)水平，可以看到5mg/kg組相比0.5mg/kg 組，受體占位率更高一些；且隨著給藥時間的延長，OX40的表達(dá)量增加。如圖2的A所示，在人體試驗中20，40，80，160，320mg在給藥后的C1D8和C2D1基本都能保持80%以上的受體占有率，但是與動物實驗不同的是，給藥后OX40的表達(dá)水平，在人體試驗中是降低的，而在動物實驗中是增加的。此外，如圖3所示，使用人CD4+T細(xì)胞進(jìn)行了OX40 受體占位率，OX40受體表達(dá)水平，T細(xì)胞增殖的相關(guān)研究，研究表明，隨著受體占位率的增加，在受體占有率達(dá)到40%以上時，OX40的表達(dá)水平開始降低。

圖1 抗鼠OX40抗體的動物實驗數(shù)據(jù)

圖2 抗人OX40抗體的人體實驗數(shù)據(jù)

圖3 抗人OX40抗體受體占有率和表達(dá)水平

二、抗體與靶點結(jié)合后，可以刺激T細(xì)胞的激活，進(jìn)行細(xì)胞進(jìn)行增殖（細(xì)胞亞群的檢測，T細(xì)胞表面的激活指標(biāo)，如CD69，HLA-DR，4-1BB, ICOS等指標(biāo)，以及反映細(xì)胞增殖的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Ki67或者直接測定血液中細(xì)胞亞型以及細(xì)胞因子，比如IFN-γ的濃度）。

如圖4，所示，OX40抗體單獨給藥，OX40與PD-1抗體聯(lián)合給藥或者OX40與CTLA-4聯(lián)合給藥情況下，Ki67陽性細(xì)胞亞群占CD4T和CD8T細(xì)胞亞群的比例，可以看到明顯的Ki67%占比隨著OX40給藥劑量的增加而增加。另外，從表1可以看出，Ki67%細(xì)胞在CD4+ effector memory細(xì)胞亞群和CD4+ effector-like亞群，IFN-γ，IP-10和CXCL10三個細(xì)胞因子，在OX40與PD-1抗體聯(lián)合給藥或者OX40與CTLA-4聯(lián)合給藥情況下，很多檢測點的結(jié)果與C1D1相比，都顯示出非常明顯的差異。

圖4 OX40抗體在CT26動物模型中的結(jié)果

表1 外周血細(xì)胞亞群分析和外周血細(xì)胞因子分析

經(jīng)過以上的分析，我們可以知道對于OX40這個靶點，藥物濃度越高，受體占位率越高，但是OX40的受體表達(dá)量，細(xì)胞因子分泌，T細(xì)胞增殖缺并非藥物濃度越高越好，因此什么樣的給藥劑量，什么樣的給藥間隔是最合適的，還需要更多的研究，尤其是臨床研究的相關(guān)結(jié)果。

圖5  BMS-986178藥物劑量與OX40受體占位率，OX40受體表達(dá)

的藥代動力學(xué)-藥效學(xué)的轉(zhuǎn)化模型

單抗激動劑藥物雖然已經(jīng)經(jīng)過了30多年的發(fā)展，但是至今沒有一個在售的藥物，單抗激動劑藥物相比免疫抑制劑類的藥物，無疑需要克服更多的挑戰(zhàn)，因此在單抗激動劑藥物的臨床和臨床前研究中，需要更多的生物分析工作的支持。熙寧生物在支持激動劑類藥物的臨床分析中，已經(jīng)積累的大量經(jīng)驗，已經(jīng)完成和正在進(jìn)行的臨床研究有十余個。已經(jīng)積累了豐富的經(jīng)驗，主要包括：

1.基于流式細(xì)胞術(shù)的淋巴細(xì)胞亞群分析，具體包括T, B, NK, Mono等亞群的占比和絕對數(shù)量分析; Treg 亞群分析；T cell EM，CM等亞群分析；

2.基于流式細(xì)胞術(shù)的T細(xì)胞激活指標(biāo)分析，包括4-1BB，CD69，HLA-DR，CD25等亞群占比分析；

3.基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞增殖分析，包括Ki67+占比分析和EdU+細(xì)胞陽性率分析；

4.基于流式細(xì)胞術(shù)的受體占位率分析；

5.基于流式細(xì)胞術(shù)的受體表達(dá)量分析；

6.基于MSD，ELISA，Luminex和CBA的細(xì)胞因子分析；

7.基于ELISPOT的T細(xì)胞，B細(xì)胞激活分析。

參考文獻(xiàn)：

Wang, R., Gao, C., Raymond, M., Dito, G., Kabbabe, D., Shao, X., … Quigley, M. (2019). An Integrative Approach to Inform Optimal Administration of OX40 Agonist Antibodies in Patients with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. doi:10.1158/1078-0432.ccr-19-0526