前言

生物療法已被批準(zhǔn)用于許多疾病的治療。與傳統(tǒng)的小分子相比，生物療法有許多優(yōu)勢(shì)，但其有可能誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生針對(duì)自身的免疫反應(yīng)，形成抗藥物抗體（anti-drug antibodies,，ADA），進(jìn)而產(chǎn)生各類副作用。中和抗體（Neutralizing antibody，NAb）是一個(gè)特殊的ADA亞種群，能夠抑制生物藥的生物活性從而減弱其藥效。考慮到ADA和NAb會(huì)嚴(yán)重影響藥物使用的有效性和安全性，在抗體藥物研發(fā)過程中必須要進(jìn)行免疫原性檢測(cè)。

基于細(xì)胞的功能性NAb試驗(yàn)是一種常用段來檢測(cè)其中和活性。但是這種檢測(cè)技術(shù)往往容易受到體內(nèi)藥物循環(huán)以及來自多種血清因子（包括但不限于生長因子和疾病相關(guān)細(xì)胞因子）的干擾。因此，酸解磁珠提取法（Bead Extraction with Acid Dissociation，BEAD）被成功創(chuàng)造并應(yīng)用于從樣本中去除循環(huán)藥物或其他干擾因素，從而富集ADA/NAb。但該技術(shù)在萃取過程中使用的強(qiáng)酸會(huì)導(dǎo)致NAb發(fā)生不可逆變性，從而導(dǎo)致NAb的測(cè)量值被低估。為避免這一現(xiàn)象，本次將為大家介紹一種新的技術(shù)：熱解離磁珠提取法（Bead Extraction with Heat Dissociation，BEHD）。該技術(shù)通過利用不同蛋白結(jié)構(gòu)所對(duì)應(yīng)的耐熱性不同，來特異性地使藥物本身發(fā)生不可逆變性，從而使樣品中仍存在活性的ADA/NAb免疫復(fù)合物被更好地檢測(cè)到。

BEHD的實(shí)驗(yàn)流程

1、將100 μL對(duì)照品或樣品添加到96孔板內(nèi)，用封板膜覆蓋， 62°C，400 rpm恒溫振蕩孵育40 - 60分鐘。

2、取出96孔板，待冷卻約15 min后，加入生物素化藥物28 μL（50 μg/mL，用含1% BSA的DPBS稀釋)，2-8℃，1000 rpm振蕩過夜。

3、將包含ADA—生物素化藥物的復(fù)合物振蕩孵育固定在250 μg鏈霉素親和素包被的磁珠上。

4、將磁珠吸附復(fù)合物用600 μL的 PBST清洗2次，用60 μL的2×RPMI-1640洗脫。

5、將50 μL洗脫液轉(zhuǎn)移到含有22 μL 100 mM HEPES的新的96孔板上。

6、后續(xù)操作參考常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、實(shí)驗(yàn)藥物和陽性對(duì)照的熱穩(wěn)定性

藥物和NAb對(duì)于溫度的耐受差異是BEHD的一個(gè)核心問題。因而，本文首先比較了實(shí)驗(yàn)藥物與多組抗實(shí)驗(yàn)藥物的NAb PCs（陽性抗體）的熱穩(wěn)定性。如圖1A和表1所示，實(shí)驗(yàn)藥物在62°C幾乎都已變性，而大部分NAb PCs在此溫度下仍能保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。其中熱穩(wěn)定性最佳的為Rabbit pAb NAb PCs。

為了進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)藥物和NAb PCs熱穩(wěn)定性的不同，將兩者在不同溫度下加熱50-60 min，然后檢測(cè)藥物和NAb PCs剩余活性。如圖1B和1C所示，在62°C的情況下，濃度等于或低于0.5 μg/mL的藥物其活性顯著降低。相反，不同劑量的NAb PCs在所測(cè)試的溫度下都保留了活性。

上述結(jié)果表明，在62°C下，大多數(shù)藥物發(fā)生了不可逆的變性，而所有檢測(cè)的NAb PCs仍能保留活性。

2、加熱代替酸處理提高抗實(shí)驗(yàn)藥物 NAb的回收率

BEHD與BEAD的主要區(qū)別在于第一步是對(duì)樣品進(jìn)行熱處理或酸處理。為了評(píng)估熱處理與酸處理的效果，作者比較了經(jīng)兩種手段分別處理后的Rabbit pAb Nab PCs的相對(duì)活性。如表2所示，62°C加熱分解藥物/NAb免疫復(fù)合物后，NAb的相對(duì)活性明顯優(yōu)于酸處理。

那是否是因?yàn)檫@類Rabbit pAb Nab PCs對(duì)酸處理過于敏感導(dǎo)致其不適用于酸處理的方法呢？因此，作者設(shè)計(jì)了一種在較低pH環(huán)境下能保持更高活性的PC——13H4。從表2可知，13H4在兩種處理下的表現(xiàn)也如同之前的PCs一樣。這表明相較于酸處理，熱處理更能保持NAb的相對(duì)活性，提高其回收率。

表2

結(jié)論

隨著生物藥物結(jié)構(gòu)、作用位點(diǎn)的不斷創(chuàng)新，許多ADA/NAb陽性抗體不能承受苛刻的酸處理，這直接導(dǎo)致了ADA/NAb回收率低，例如有聚乙二醇化結(jié)構(gòu)域的抗體就不耐受低pH的環(huán)境。因此創(chuàng)造一種不基于“酸處理”的方法顯得十分重要。在本文中，作者也驗(yàn)證了熱解離磁珠提取法（BEHD）法具有良好的耐藥性、精密度和靈敏度，可應(yīng)用于免疫安全性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中。然而，該方法也存在一定局限性。此方法的前提是實(shí)驗(yàn)室需具備特殊儀器用于檢測(cè)相關(guān)蛋白的耐熱情況。并且，它只適用于ADA/NAb陽性抗體的耐熱性高于藥物蛋白本身的實(shí)驗(yàn)方法。

同時(shí)，該方法跳出常規(guī)實(shí)驗(yàn)思路，從蛋白的基本物理性質(zhì)層面去優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，也為我們之后的方法開發(fā)提供了一個(gè)新角度。

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