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最近GLP-1領(lǐng)域捷報頻傳，諾和諾德司美格魯肽注射液新適應(yīng)癥在國內(nèi)申報上市，禮來的GCGR/GIPR/GLP-1R三重激動劑Retatrutide在48周治療時間內(nèi)幫助肥胖者體重減輕了24.2%。作為降糖與減肥領(lǐng)域的熱門靶點，GLP-1一直保持著市場熱度，引得國內(nèi)外各大制藥公司競相布局。
GLP-1即胰高血糖素樣肽，屬于腸促胰島素家族，以葡萄糖濃度依賴性方式促進胰島β細胞分泌胰島素，參與機體血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。人體分泌的GLP-1半衰期很短，僅為1~2分鐘，分泌到血液循環(huán)后易被二肽基肽酶4（DPP-4）快速降解而失去促胰島素分泌的活性。GLP-1可減緩胃排空，還可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)上的受體，從而降低食欲，最終起到降低血糖與體重的作用。此外，GLP-1藥物在非酒精性脂肪肝、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面也具有潛在的治療價值。
圖1 GLP-1作用示意圖
為了充分發(fā)揮GLP-1的藥效，藥物研發(fā)人員在天然GLP-1的基礎(chǔ)上進行相關(guān)改造，使其能夠耐DPP-4酶降解，延長其腸促胰島素活性，減少藥物使用的頻率。
在藥物的臨床試驗過程中，PK、ADA、NAb是生物制品生物分析中的關(guān)注點，GLP-1藥物也不例外，下面筆者將結(jié)合自身的項目經(jīng)驗，一一來闡述其中的關(guān)鍵點。
PK
由于GLP-1的作用靶點是細胞膜上的GLP-1R，GLP-1R屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，它的典型特征是具有一個七次跨膜的結(jié)構(gòu)域，這使得重組表達的GLP-1R很難保持和GLP-1的高親和力，難以作為靶蛋白應(yīng)用到GLP-1的檢測實驗中。GLP-1結(jié)構(gòu)類似藥物的PK通常選擇雙抗夾心的原理進行設(shè)計。
GLP-1融合蛋白作為激動劑藥物，臨床用藥劑量相對較低，靈敏度要求通常在幾ng/mL，可使用定制的抗體對或商品化抗體實現(xiàn)PK濃度的檢測。
ADA
可采用橋聯(lián)法來設(shè)計ADA檢測模式，為了改善藥物耐受，采用酸化解離樣品后經(jīng)固相包被藥物的載體捕獲ADA，然后將ADA酸洗脫下來的方式進行樣品純化后檢測。純化后的樣品也可采取物理吸附的方式結(jié)合到分析板上，然后用標記的藥物作為檢測試劑進行檢測。
圖2 ADA檢測原理示意圖
GLP-1融合蛋白藥物屬于內(nèi)源性GLP-1的類似物，在ADA檢測中除了常規(guī)的篩選→確證→滴度三層級檢測外，還需對在確證實驗中檢測為陽性的樣品進行內(nèi)源性GLP-1交叉反應(yīng)實驗，以了解抗藥抗體是否有影響內(nèi)源性GLP-1的風險。
NAb
基于藥物的作用機理，GLP-1類藥物的中和抗體分析應(yīng)采用細胞法。
功能細胞株高表達GLP-1R，GLP-1的結(jié)合使細胞活化，胞內(nèi)cAMP 濃度上升，通過下游信號通路，激活熒光素酶報告基因的轉(zhuǎn)錄，在加入底物后產(chǎn)生化學信號。當中和抗體存在時會阻礙藥物和細胞上的GLP-1R結(jié)合，抑制細胞的活化，表現(xiàn)為信號降低。
圖3 中和抗體檢測原理示意圖
熙寧生物|精翰生物有自主知識產(chǎn)權(quán)的GLP-1R，GCGR和GIPR報告基因功能學細胞株，具備>50倍以上的信噪比，人血清耐受性和特異性，具備穩(wěn)定的方法學性能，可服務(wù)于臨床中和抗體檢測，臨床前藥物篩選和CMC放行，功能細胞株部分活性數(shù)據(jù)如下：
GLP-1R報告基因細胞株數(shù)據(jù)：
Dulaglutide的劑量權(quán)限，結(jié)果顯示GLP-1R報告基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株復(fù)孔間信號CV非常小，有明顯的上下劑量曲線平臺期，信號窗口S/N為118。
Dulaglutide中和抗體有明顯的抑制Dulaglutide刺激GLP-1R報告基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的作用，中和抑制曲線明顯，中和抗體的靈敏度約為150ng/mL，方法學靈敏。
GIPR報告基因細胞株數(shù)據(jù)：
標準品為Gastric Inhibitory Peptide (GIP)。結(jié)果顯示，含20%混合人血清的反應(yīng)體系，其基質(zhì)效應(yīng)明顯高于含5%和10%混合人血清的反應(yīng)體系。而含5%和10%混合血清的反應(yīng)體系結(jié)果相差不大。
標準品為Gastric Inhibitory Peptide (GIP)，對照品為Liraglutide, Human Glucagon(1-29)和Dulaglutide。結(jié)果顯示，Liraglutide, Glucagon(1-29), Human和Dulaglutide沒有非特異信號產(chǎn)生，特異性良好。
GCGR報告基因細胞株數(shù)據(jù)：
標準品為Glucagon(1-29),Human。結(jié)果顯示GLP-1R報告基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株復(fù)孔間信號CV非常小，有明顯的劑量依賴信號響應(yīng)，信號窗口S/N大于100倍。
Glucagon作為刺激劑， Hu1803-9D標準曲線梯度稀釋加入體系中。結(jié)果顯示，Hu1803-9D對Glucagon的抑制作用隨Hu1803-9D濃度升高而增大，且在含有5%混合人血清的環(huán)境中與培養(yǎng)基組沒有明顯差異。
熙寧生物|精翰生物已為多種GLP-1類藥物提供一站式生物分析服務(wù)，包括PK,ADA,Nab等，類型覆蓋GLP-1,GIP和GCGR類似物及多功能蛋白，具備豐富的方法學開發(fā)和樣本檢測經(jīng)驗，歡迎后臺留言咨詢交流。
