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近些年腫瘤免疫療法迅速發(fā)展，諸如CART、TIL、雙抗等高效的免疫療法在臨床試驗中已展現(xiàn)出明顯的腫瘤殺傷和臨床有效性，其中一些藥物已經(jīng)獲批上市，許多患者因此受益，生命得到延續(xù)。在這些藥物研究的過程中，細胞因子釋放綜合征作為一種常見的免疫治療不良反應事件受到廣泛關注。
細胞因子屬于小分子蛋白質(zhì)，對細胞間的相互作用及信號傳導有影響。細胞因子包括淋巴因子、單核細胞因子、趨化因子、白介素等，既有促炎細胞因子也有抗炎細胞因子。有些細胞因子在適量情況下可以起到抑制腫瘤的作用，例如NK細胞受刺激后通過穿孔素/顆粒酶通路或凋亡誘導配體溶解腫瘤，分泌干擾素-γ，抑制腫瘤細胞增殖、增強腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)抗原呈遞，抑制血管生成。免疫細胞在抵抗外來入侵或清除異常時會釋放大量促炎因子（如干擾素、白細胞介素、腫瘤壞死因子等）。當免疫系統(tǒng)獲得勝利后，便會減少細胞因子的釋放，維持機體穩(wěn)態(tài)。然而，在進行免疫治療時，如果免疫系統(tǒng)過度激活，便會產(chǎn)生過多的細胞因子，引發(fā)細胞因子風暴。細胞因子風暴又稱為細胞因子釋放綜合征（CRS），是一種常見的免疫治療并發(fā)癥，盡管這種不良反應發(fā)生率比較低，但CRS一旦發(fā)生就會引發(fā)全身的炎癥反應，嚴重時可能危及生命。
目前臨床上最常見的細胞因子風暴檢測指標包括IL-6、TNF-α、IFN-γ等，可以通過多因子組合進行檢測以節(jié)省樣本體積和檢測成本，提高檢測效率。
細胞因子屬于生物標志物的范疇，由于生物標志物的復雜性，目前還沒有明確的方法驗證指南文件。2018年版FDA發(fā)布的BMV指南中提到：當生物標志物數(shù)據(jù)用于支持監(jiān)管決策時，例如用于藥物安全性和/或有效性的重要決定，或用于支持藥物標簽中的劑量說明時，其分析方法應得到充分驗證。但同時，對于生物標志物的方法學做到何種程度，建議基于fit for purpose原則來確定。例如：對于用于支持監(jiān)管決策的指標，應進行完整驗證，對于探索性指標，進行部分驗證或方法測試。
方法的完整驗證參考PK的驗證要求，完整驗證包括至少準確度和精密度、平行性、基質(zhì)效應、稀釋線性和穩(wěn)定性。
由于大多數(shù)生物標志物在基質(zhì)中有一定的內(nèi)源性水平，標準曲線通常配制在緩沖液或替代基質(zhì)中，如果可以篩選到足夠的幾乎不含內(nèi)源性生物標志物的基質(zhì)，也可以采取和PK相同的方式進行方法學。
質(zhì)控樣品應使用基質(zhì)來制備，優(yōu)先選擇合適內(nèi)源性水平的基質(zhì)作為各濃度水平的質(zhì)控樣品（ULOQ、HQC、MQC、LQC、LLOQ），如果沒有合適的內(nèi)源性基質(zhì)，可在基質(zhì)中加入適當濃度的標準品來制備。
對于多因子檢測方法，由于同一個體基質(zhì)中不同因子的濃度水平可能會有較大差異，對于難以協(xié)調(diào)的因子，可以單獨設置其質(zhì)控樣品。
準確度和精密度
準確度和精密度的考察將通過6個分析批進行，每個分析批包含一套標準曲線和三套五個水平的質(zhì)控樣品，用所有質(zhì)控樣品的濃度數(shù)據(jù)計算批內(nèi)和批間的準確度和精密度。
各濃度水平的質(zhì)控樣品濃度可以在方法驗證前采用至少三個分析批測定后取平均值來確定，也可以在方法驗證期間的準確度和精密度實驗中確定。
平行性
由于生物標志物所使用的重組蛋白標準品是一種替代參照品，和內(nèi)源性待測物并不完全一樣，所以生物標志物的平行性考察尤為重要。平行性考察可以告訴我們替代標準品和內(nèi)源性待測物在檢測方法中的表現(xiàn)是否一致。通過將純基質(zhì)的樣品使用和配制標準曲線樣品相同的稀釋液進行序列稀釋，不同稀釋度的樣品乘以稀釋倍數(shù)后濃度之間的%CV在30%以內(nèi)，則平行性考察通過。
選擇性
選擇性，也可以稱為基質(zhì)效應，可通過在個體基質(zhì)中分別加入高濃度和低濃度水平的標準品進行考察，需要注意在計算回收率時要將內(nèi)源性水平考慮進去。另一種方式是加入一定濃度的標準品后進行序列稀釋，以第一濃度點作為參考值計算后續(xù)稀釋樣品點的偏差，也就是說當不同稀釋度的樣品點在乘以稀釋倍數(shù)后得到的濃度值接近時，就說明含不同比例的基質(zhì)對檢測沒有影響，就可以認為無基質(zhì)效應。
稀釋線性
如果預期將來的樣品會產(chǎn)生高于定量上限的濃度，則需要證明稀釋線性。稀釋線性的考查方式和平行性類似，區(qū)別在于稀釋線性需要根據(jù)將來樣品的預期能達到的最高濃度配制加標樣品，使用該高濃度加標樣品作為起始樣品進行稀釋后考察。在樣品預計的稀釋倍數(shù)不高于平行性中評估的稀釋倍數(shù)時，也可以基于平行性測試對稀釋線性進行評估。
穩(wěn)定性
穩(wěn)定性包含室溫、2-8℃、凍融及長期穩(wěn)定性。不同于PK方法，生物標志物的穩(wěn)定性以基線測定濃度作為參考值進行處理后樣品的評估。
熙寧生物|精翰生物積累了大量的細胞因子檢測經(jīng)驗，對于常見的細胞因子已開發(fā)相應的自主產(chǎn)權方法學，如7因子方法學(IL-2、LI-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、TNF-α)，10因子方法學等，可用于細胞因子釋放及臨床樣本的檢測，為申辦方節(jié)省方法學建立的時間和費用成本。同時生物標志物平臺目前已具備全面覆蓋不同樣本的檢測能力，從組織、細胞、蛋白、基因分子各個維度都可以提供相應的檢測方案，歡迎各位交流咨詢。
已有生物標志物自主產(chǎn)權方法(部分)
