大多數測定游離藥物靶點的方法都是基于捕獲試劑和抗體藥物競爭與靶點結合的原理。測試方法的特異性和對靶標生物學的理解是建立可靠的游離靶標分析方法的關鍵。

臨床前或臨床階段測定靶點可遵循以下先決條件：捕獲抗體或檢測抗體應與藥物是否有競爭關系。

圖a  總靶點與游離靶點檢測方法對比

Total target：抗體對中兩個抗體與藥物均是非競爭關系。檢測抗體及捕獲抗體和藥物結合靶點的位點均是不相同的。

Free target：抗體對中有且只有一個與藥物是競爭關系。檢測抗體與藥物結合靶點的位點是相同的，而捕獲抗體與藥物結合靶點的位點是不同的；或捕獲抗體與藥物結合靶點的位點相同，而檢測抗體與藥物結合靶點的位點不同。

·   基質效應

檢測中通過對樣品高度稀釋來減少未知來源的基質干擾，但此方式會引起靶點-藥物復合物的解離并與檢測試劑結合，這可能導致對游離靶點的潛在高估。此問題有兩種解決方案：①開發(fā)較小稀釋倍數或不稀釋樣本的分析方法；②稀釋樣本并恰當地報告結果。

如果可行，始終優(yōu)先考慮方案①。然而在未稀釋的樣本中消除基質干擾是一項困難的工作，因為生物基質是復雜的，并且在血漿和血清中總蛋白濃度很高。

這里提供一種在未稀釋或較小稀釋的樣本中消除基質干擾的思路，即使用不含內源性分析物的血清/血漿制備標準曲線，使標準曲線和樣本具有相同的基質效應，以解決基質效應問題。

獲得這種不含內源性分析物的基質最直接的方法是使用藥物將所有待測物耗竭掉，并避免耗竭后過量的藥物進入基質中。圖b.一種使用磁珠耗竭基質中內源性靶點的方法舉例。

這種方法可以有效的解決基質效應，但對操作要求較高，需要摸索各種試劑濃度。

圖b  一種使用磁珠耗竭基質中內源性靶點的方法

步驟簡述：

1）包被藥物的磁珠耗竭基質中的靶點；

2）空磁珠耗竭過量的包被藥物（否則藥物會對靶點的檢測有抑制作用）；

3）獲得純化后的基質（不含靶點，不含藥物），用于配制標曲，從而獲得了與真實樣品組分相似的標曲，解決了基質效應。

·    藥物-靶點分子復合物的解離

除稀釋樣品會造成對游離靶點的潛在高估外，另一個因素是，對于某些藥物，給藥后由于機體本身的代償機制，機體會產生更多的靶點（total target顯著升高），以彌補給藥后靶點的虧損。由于藥物-靶點復合物在檢測過程中處于動態(tài)平衡轉化的狀態(tài)，導致方法檢測出從復合物中解離出來的靶點，使游離靶點被高估。

為了進一步減少靶點從復合物中解離并在檢測中產生的附加效應，可以在LBA分析之前，采用某些方式對樣品進行預處理，以耗竭其中的藥物或藥物-靶點復合物，從而提高游離靶點的檢測準確性。

對于雙特異性抗體藥物，可利用其對另一靶點的第二特異性選擇性地耗竭藥物或藥物-靶點復合物，對于單克隆抗體藥物，也可以使用靶點的非競爭型抗體耗竭藥物或藥物-靶點復合物。如圖c.利用磁珠預處理樣品的方法定量測定游離靶點A。

圖c  利用磁珠預處理樣品的方法定量測定游離靶點A

步驟簡述：

1）利用抗藥物另一端的抗體(抗-抗靶點B)或靶點B去耗竭樣品體系中的藥物以及藥物-靶點A；

2）藥物耗竭后的游離靶點A用free target方式進行檢測。

PART 02

注：處理前，同一個樣品經過不同倍數的稀釋，濃度差異較大，基質干擾較大。

處理后，同一個樣品經過不同倍數的稀釋，濃度較為恒定，無基質干擾。

PART 03

使用耗竭待測靶點的空白基質有效地解決了基質效應問題，同時可以允許使用較低的MRD減少了靶點與藥物的解離。

此外，通過耗竭樣品中游離藥物或藥物-靶點復合物的方式可以對游離靶點進行準確定量，調整捕獲試劑和樣品孵育時間可以大大減少靶點分子從藥物-靶點復合物中解離的機會，從而減少對游離靶點的潛在高估。

此游離靶點的定量方法穩(wěn)健可靠、準確、精確并且無基質效應，可應用于臨床前或臨床階段項目的研究。

熙寧生物 | 精翰生物在大分子生物分析領域有多年的項目經驗（單雙抗、細胞治療、基因治療和一些新型藥物）。對于有難度的挑戰(zhàn)性的方法學建立具備豐富經驗，技術過硬，響應迅速，且在生物分析的同時，能從申辦方角度對數據進行科學性的分析，并于臨床需求進行關聯分析，建立合規(guī)，科學，適用臨床需求的方法。歡迎大家后臺留言咨詢交流。